[發明專利]一種溫度兩階段控制策略發酵生產F.solani pisi角質酶的方法

無效

• 申請號: 200810022620.X
• 申請日: 2008-07-16
• 公開（公告）號: CN101323848A
• 公開（公告）日: 2008-12-17
• 發明（設計）人: 陳堅;吳敬;張芙華
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/16
• 分類號: C12N9/16;C12R1/125
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

一種溫度兩階段控制策略發酵生產F.solani?pisi角質酶的方法，涉及環境因素(溫度、pH)分階段控制策略在發酵過程優化中的應用技術領域。

背景技術

角質酶(Cutinase)是一種多功能酶，屬絲氨酸酯酶的一種，相對分子質量約為22～30kD，是一種具有稱作α/β水解酶折疊的共同結構框架的蛋白質，既可水解不溶性多聚體角質，也可以作用于其它長鏈、短鏈脂肪酸酯、乳化的甘油三酯和可溶性的合成酯等。除了水解反應外，角質酶還能參與酯化、轉酯化等反應。因此其在紡織業、食品工業以及生物催化、化工工業等諸多領域有著廣泛的應用前景，特別是在紡織工業的應用是近幾年開發的新領域，它是繼堿性果膠酶之后的另一種主要新型紡織品清潔生產的酶制劑。其同樣可以作為棉織物生物精練處理過程中重要的酶制劑，其研制及在棉針織物精練中的應用，使另一種全新溫和的綠色精練方式成為可能。角質酶在生物精練處理過程中，能有效分解棉纖維表面疏水性的角質和臘酯，使疏水性物質從棉纖維表面脫落，從而達到精練效果，而纖維本身不受到損傷，如果角質酶和堿性果膠酶混合使用處理棉纖維則效果更佳。因此，經生物精練的棉纖維能最大程度的保持纖維強度，失重小，織物手感柔軟厚實，且富有彈性，并且克服了傳統堿精練過程中棉纖維損失較大，強度損傷嚴重及環境污染嚴重等缺點。

角質酶雖然有很廣泛的應用前景，但國內外迄今為止并沒有工業化生產角質酶的成功實例，角質酶市場仍處于空白。本實驗室通過基因手段構建的產F.solani?pisi角質酶工程菌是以Bacillus?subtilis作為宿主，此菌種表達量較高，通過在搖瓶發酵條件優化以及在3L發酵罐上發酵條件的優化，確定了發酵工藝，為實現工業化生產奠定基礎并且填補國際角質酶工業化生產空白，同時帶來極高經濟價值。

發明內容

本發明的目的是提供一種利用基于pH分階段控制的溫度兩階段控制策略發酵生產F.solani?pisi角質酶的方法，本發明的優點在于工藝簡單易行，能有效地提高角質酶的產量及生產強度。

本發明的技術方案：

菌種：重組芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)WSHB?06-07為出發菌株，該菌株已在【中國生物工程雜志China?Biotechnology，2008，28(5)：59～64】公開。

菌體保持培養基(g/L)：蛋白胨10，酵母膏5，氯化鈉10，甘油50％(v/v)。

種子培養基(g/L)：葡萄糖10，蛋白胨12，酵母膏24，磷酸氫二鈉12.54，磷酸二氫鉀2.31，pH?7.5。

發酵培養基(g/L)：蔗糖32.5，蛋白胨37，酵母膏24，磷酸氫二鈉12.54，磷酸二氫鉀2.31，七水硫酸鎂4.4，pH?7.5。

培養方法：將保藏好的菌種接入種子培養基中，500mL三角瓶裝50mL培養基，回轉式搖床轉速200r/min，37℃，培養14～16h。將培養好的種子以4％接種量接入到3L全自動發酵罐KBT(KoBio?Tech?Co.，Ltd.，韓國)中，裝液量1L；兩階段控制策略發酵生產F.solani?pisi角質酶：菌體生長階段：控制溫度為37℃、pH?7.5、攪拌轉速600r/min、通氣量為1.5vvm直到菌體OD₆₀₀達到12.65；高效表達階段：當菌體OD₆₀₀達到12.65，菌體生長進入對數生長期后，將發酵溫度降到30℃、pH?6.5、攪拌轉速600r/min、通氣量為1.5vvm，直到發酵結束。

角質酶活性測定：取稀釋適當倍數的樣品900μL，加入100μL?2mol/L的NaOH溶液，混勻后于沸水浴中反應10min，立即用流動冷水冷卻至室溫，再向其中加入1mL間苯二酚和3mL?10mol/L的HCl，混勻后于沸水浴中反應8min，立即用流動冷水冷卻至室溫，然后用分光光度計測定其500nm處的吸光度。

本發明的有益效果：利用本發明能大幅提高角質酶的產量及生產強度，產量由170U/mL提高到312U/mL，生產強度由11.74U/mL/h提高到13.2U/mL/h，并能夠減少發酵液中雜蛋白的含量，提高了產品純度和下游提取時的效率，并且減少了能耗，有利于工業化大規模生產，彌補了角質酶工業化生產的空白，推動了角質酶在棉紡織業的應用，從而促進紡織工業的發展。

本發明采用基于pH分階段控制策略的溫度兩階段控制策略在3L罐上發酵達到先進水平，并且對其它的重組菌的發酵具有一定的指導意義。

具體實施方式