[發(fā)明專利]一種地西泮膠體金法檢測(cè)試紙及制備方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810022250.X
• 申請(qǐng)日: 2008-06-30
• 公開（公告）號(hào): CN101320039A
• 公開（公告）日: 2008-12-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胥傳來(lái);李秋生;劉麗強(qiáng);袁緩;彭池方;胡擁明
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/52
• 分類號(hào): G01N33/52;G01N33/558
• 代理公司: 無(wú)錫市大為專利商標(biāo)事務(wù)所
• 代理人: 時(shí)旭丹;劉品超

技術(shù)領(lǐng)域

一種地西泮膠體金法檢測(cè)試紙及制備方法，屬于生物學(xué)免疫方法的測(cè)定技 術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

地西泮(Diazepam)為苯二氮卓類鎮(zhèn)靜安眠藥，化學(xué)名稱為：1-甲基-5-苯基-7- 氯-1，3-二氫-2H-1，4-苯并二氮卓-2-酮。曾用作動(dòng)物飼料添加劑，作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑， 具有使動(dòng)物嗜睡少動(dòng)，生長(zhǎng)快且有改變?nèi)赓|(zhì)的作用。也用在屠宰和動(dòng)物檢疫之前， 或?qū)?dòng)物轉(zhuǎn)移屠宰之前，起鎮(zhèn)靜作用，以減輕動(dòng)物緊張狀態(tài)，降低動(dòng)物傷害和死 亡率。此類藥物常見(jiàn)嗜睡，可見(jiàn)無(wú)力、頭痛、暈眩、惡心、便秘，偶見(jiàn)皮疹、肝 損害、骨髓抑制等不良反應(yīng)。若隨意在飼料中添加此類藥物，蓄積的藥物通過(guò)食 物鏈進(jìn)入人體，將造成巨大的危害。為此許多國(guó)家將此類藥物列入禁用藥物名 單。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)地西泮的檢測(cè)主要有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜 法(GC)、薄層色譜法(TLC)、氣-質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS)、液-質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS)等，但 這些方法不僅需要昂貴的儀器設(shè)備，對(duì)檢材的要求也比較高，需要進(jìn)一步的提 純處理才能進(jìn)行，且不能適應(yīng)高通量、現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)。因此實(shí)現(xiàn)具有快速， 便攜優(yōu)點(diǎn)的免疫檢測(cè)方法的多殘留檢測(cè)具有現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種地西泮膠體金法檢測(cè)試紙及制備方法，為了克服 現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)的缺陷，提供一種便攜，快速適合進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)地西泮的免疫層 析色譜檢測(cè)法(gold?immunochromatography?assay；GICA)。

本發(fā)明的技術(shù)方案：一種地西泮膠體金法檢測(cè)試紙，由樣品墊、結(jié)合釋放 墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和塑料底板組成，塑料底板上依次粘貼樣品墊、結(jié) 合釋放墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，結(jié)合釋放墊上包被了抗地西泮多抗-膠體金 標(biāo)記物，硝酸纖維素膜上依次包被有地西泮偶聯(lián)抗原和羊抗兔IgG抗體，以地 西泮偶聯(lián)抗原作為測(cè)試線，以羊抗兔IgG抗體作為質(zhì)控線；

制備步驟為：

(1)將地西泮與牛血清蛋白分子進(jìn)行偶聯(lián)，作為地西泮偶聯(lián)抗原；

(2)用地西泮偶聯(lián)抗原按常規(guī)方法免疫制得抗地西泮多抗；

(3)用檸檬酸三鈉還原劑將氯金酸還原制成20nm-40nm膠體金顆粒；

(4)將3mL膠體金調(diào)至pH?9，攪拌下逐滴加入蛋白濃度為0.2mg/mL的抗地 西泮多抗0.05mL，放置30min后加入5％牛血清蛋白BSA溶液使終濃度為1％， 放置至少30min后，10000轉(zhuǎn)離心50min，移去上清液后用含5％蔗糖的0.002mol/L pH?9.0的硼酸鹽緩沖液3mL重懸，重復(fù)2次，最后用0.3mL緩沖液溶解，得到 穩(wěn)定的抗地西泮多抗-膠體金標(biāo)記物；

(5)將抗地西泮多抗-膠體金標(biāo)記物包被在膠體金結(jié)合釋放墊上，將地西泮偶 聯(lián)抗原和羊抗兔IgG抗體分別包被在硝酸纖維素膜上，地西泮偶聯(lián)抗原作為測(cè) 試線和羊抗兔IgG抗體作為質(zhì)控線，在37℃烘箱干燥；

(6)試紙條的組裝：將樣品墊、結(jié)合釋放墊、硝酸纖維素膜、吸水墊由一端 依次黏附在塑料底板上，即得到用于免疫檢測(cè)的地西泮膠體金法檢測(cè)試紙。

本發(fā)明檢測(cè)原理是利用樣品墊形成的毛細(xì)管虹吸效應(yīng)，使被檢測(cè)物質(zhì)首先 與膠體金標(biāo)記的抗地西泮多抗發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)形式的結(jié)合，其后果是，當(dāng)膠體金標(biāo)記 的抗地西泮多抗過(guò)量時(shí)，多余的多抗漂移到測(cè)試線，與地西泮偶聯(lián)抗原結(jié)合并 顯色；而與檢測(cè)物結(jié)合的膠體金標(biāo)記的抗地西泮多抗，其V區(qū)結(jié)合位點(diǎn)被檢測(cè) 物質(zhì)占據(jù)，只能跨越測(cè)試線漂移到質(zhì)控線以C區(qū)位點(diǎn)與羊抗兔IgG抗體非特異 性結(jié)合，同測(cè)試線進(jìn)行比色而得到檢測(cè)結(jié)果。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明應(yīng)用層析式一步競(jìng)爭(zhēng)法原理，試紙中上下線比 色來(lái)半定量檢測(cè)血清或尿液樣品中的地西泮殘留量，在5-10min內(nèi)，快速準(zhǔn)確地 檢測(cè)出樣品是否含有地西泮，以確定地西泮是否超標(biāo)，能夠滿足食品安全對(duì)地 西泮殘留量檢測(cè)需求，適用于屠宰企業(yè)及政府檢測(cè)機(jī)構(gòu)。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其效果不言而喻，即具有使用方便、經(jīng)濟(jì)快捷、 制作容易、成本低廉的特點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1本發(fā)明地西泮膠體金法檢測(cè)試紙的側(cè)視圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：地西泮檢測(cè)試紙的制備

(1)將地西泮與牛血清蛋白分子偶聯(lián)，作為地西泮偶聯(lián)抗原，

(2)用地西泮偶聯(lián)抗原免疫獲得抗地西泮多抗：