[發明專利]一種微囊藻毒素-LR的免疫熒光猝滅檢測方法

無效

• 申請號: 200810022245.9
• 申請日: 2008-06-27
• 公開（公告）號: CN101382541A
• 公開（公告）日: 2009-03-11
• 發明（設計）人: 胥傳來;徐麗廣;彭池方;陳偉;馬偉;李灼坤
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/532
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所
• 代理人: 時旭丹;劉品超

1.一種微囊藻毒素-LR的免疫熒光猝滅檢測方法，其特征是包括免疫原、包 被原、和抗體的制備，磁性納米粒子的修飾，磁性納米粒子與包被原的偶聯， 金納米粒子的制備，金納米探針的制備，包被原的固定，流動注射系統中的免 疫反應，熒光酶標板的包被和流動注射熒光猝滅的檢測；工藝步驟為：

(1)包被原的制備：將微囊藻毒素-LR與卵清蛋白相偶聯得到包被原；

①取微囊藻毒素-LR?0.5mg溶于250μL的N，N-二甲基甲酰胺中，得C液；

②取三正丁胺15μL溶于250μL的N，N-二甲基甲酰胺中，得D液；

③將D液加入到C液中；

④取氯甲酸異丁酯12μL，溶于500μL?N，N-二甲基甲酰胺中，4℃攪拌下逐 滴加入到C液中，反應1h；

⑤取牛血清蛋白6mg溶于3mL?pH?9.0、50mmol/L的碳酸鈉溶液，將上述反 應液于18℃攪拌下逐滴加入到牛血清蛋白質溶液中，室溫反應12h，即得到微囊 藻毒素-LR-OVA偶聯物的混合液；

⑥將微囊藻毒素-LR-OVA偶聯物的混合液移入透析袋中，用6×1L的去離子 水透析4-6天，最后使用凍干法將透析袋中的液體制成粉末，即得到人工抗原： 微囊藻毒素-LR-OVA，用作包被原；

(2)免疫原的制備：將微囊藻毒素-LR與牛血清蛋白相偶聯得到免疫原；

①取0.25mL溶解有微囊藻毒素-LR的乙醇溶液，加入0.75mL去離子水， 加入150μL的碳二亞胺，得A液；

②用1mL25％的乙醇溶液溶解2mg的牛血清蛋白BSA，得B液；

③將A液逐滴加入到B液中，再加入150μL的碳二亞胺，混勻，4℃反應12h， 得到微囊藻毒素-LR-BSA偶聯物的混合液；

④將微囊藻毒素-LR-BSA偶聯物的混合液移入透析袋中，用6×1L的去離子 水透析4-6天，最后使用凍干法將透析袋中的液體制成粉末，即得到人工抗原： 微囊藻毒素-LR-BSA，用作免疫原；

(3)抗體的制備：用所得免疫原按常規方法免疫得到特異性多克隆抗體；

(4)磁性納米粒子的修飾：將制備的Fe₃O₄種子用3-氨丙基三乙氧基硅烷修 飾；用二次蒸餾水分別配制FeSO₄·7H₂O和FeCl₃·6H₂O的溶液及NaOH溶液， 將所配兩種鐵鹽溶液混合，在鐵鹽的混合溶液中Fe²⁺離子的濃度為0.12mol/L， Fe³⁺的濃度為0.2mol/L；NaOH溶液的濃度為2.5mol/L，在劇烈攪拌下將一定 體積的NaOH溶液緩慢滴加到混合鐵鹽溶液中，將所得的沉淀在60℃陳化2小 時，用二次蒸餾水將沉淀物清洗數次，過濾后再在60℃干燥24小時，在瑪瑙研 缽中研磨后所得產物為Fe₃O₄種子；將微囊藻毒素-LR-OVA?0.125g用100mL乙 醇和1mL水溶解，超聲30min，滴加0.4mL?3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES，室 溫攪拌7小時，以8000r/min離心30min，將APTES修飾的Fe₃O₄納米顆粒從反 應介質中分離，并用乙醇溶液對其清洗5次，過濾后再在60℃干燥24小時，備 用；

(5)磁性納米粒子與包被原的偶聯：取修飾的磁性納米粒子10mg，N-羥基 琥珀酰亞胺NHS?11.5mg，N，N-二環己基二亞胺DCC?20.63mg，加入到3mL?N，N- 二羥基甲酰胺中，室溫攪拌反應過夜，離心去沉淀，上清液再與3mL含60mg卵 清蛋白OVA的溶液在4℃下攪拌反應過夜，離心，上清液用超純水透析3天，對 透析袋中溶液進行磁性分離，棄上清，加入含2％明膠的封閉液封閉，再加入PBST 洗滌液，洗滌后磁分離，去上清，最后向磁性分離過的離心管中加入1mL 0.02mol/L?pH7.6的Tris緩沖液，4℃保存備用；

(6)兩種粒徑的金納米粒子的制備：所有的玻璃儀器都強酸浸泡，雙蒸水清 洗，晾干備用；制備時，向潔凈的三角燒瓶中加入100mL濃度為0.01％的氯金酸， 加熱，煮沸，緊接著加入1％的檸檬酸三鈉溶液3.5mL或1mL，邊加熱邊攪拌， 溶液顏色從淡黃色變成紅色，反應持續6-8分鐘檸檬酸三鈉使金納米粒子完全沉 降，所得金納米粒子粒徑對應分別為13nm或30nm，最后，溶液分別冷卻至室溫， 稀釋到100mL，4℃保藏；

(7)兩種金納米探針的制備：

30nm金納米探針的制備：首先，30nm金納米粒子與1.5μg的羊抗兔在pH9.1 堿性水溶液中攪拌反應，緊接著，向溶液中加入巰基修飾的寡核苷酸 5’-tacgagttgagaccgttaagacgaggcaatcatgcaatcctgaatgcgt(10)-SH-3’，室溫反應20小時， 再用含0.1M?NaCl的10mM磷酸鹽緩沖溶液調節pH值至7.0，鹽陳40小時后于 -4℃下2000r.p.m離心30分鐘，棄上清，紅色沉淀物用含0.1M?NaCl的10mM磷酸 鹽緩沖溶液溶解，加入1.5μM的目標探針 5’-cgcattcaggattgcatgaatgcctcgtcttaacggtctcaactcgta-3’37℃雜交4小時，再次離心 去上清，雜交過程重復4次，沉淀最后溶解于含0.3M?NaCl的10mM磷酸鹽緩沖 溶液，作為儲備液4℃保藏；

13nm金納米探針的制備：直接向金納米溶液中加入巰基寡核苷酸 5’-GGCAATCATGCAATCCTGAATGCGa(10)-SH-3’，室溫反應20小時，再用含 0.1M?NaCl的10mM磷酸鹽緩沖溶液調節pH值至7.0，鹽陳40小時后于-4℃下 2000r.p.m離心30分鐘，棄上清，紅色沉淀物用含0.1M?NaCl的10mM磷酸鹽緩沖 溶液溶解，4℃保藏；

(8)包被原的固定：用所得包被原與磁性微粒偶聯，并固定于玻璃微通道內；

先用含0.1M?NaCl、pH?7.0的0.01M磷酸鹽緩沖液作為洗液清洗微管和免疫反 應池，然后將40μL?0.5mg/mL抗原修飾的超順磁納米粒子溶液吸入螺線管中，再 以5μL/s的速率注入免疫反應池內，電磁鐵通電，吸附磁珠，將其固定在反應池 內；

(9)流動注射系統中的免疫反應：將預孵育的50μL抗體和50μL微囊藻毒素 -LR混合溶液吸入螺線管中，其中，微囊藻毒素-LR容解于含0.05％Tween-20 pH7.40.01M?PBST中，濃度從1pg/ml到100pg/ml；然后，將混合溶液注入免疫反 應池中室溫反應10分鐘，再以20μL/s的速度注入400μL含0.1M?NaCl的pH7.0、 0.01M磷酸鹽緩沖液洗液，之后，將100μL的羊抗兔抗體及雙鏈DNA共同修飾 的30nm金探針的溶液以1μL/s的速度注入反應池，反應6分鐘，沖洗；以2μL/s的 速度注入100μL的雙蒸水，60℃反應6分鐘，最后再注入100μL的雙蒸水，收集所 需單鏈DNA，撤去磁場，洗滌柱子以備再用；

(10)熒光酶標板的包被：用親和素包被熒光酶標板，向酶標板每孔中加入 100μL?pH9.6的親和素碳酸鈉緩沖溶液，4℃孵育過夜，用PBS清洗后，備用；

(11)流動注射熒光猝滅的檢測：利用間接競爭免疫檢測將微囊藻毒素-LR和 多克隆抗體通過玻璃微通道內，競爭結合后的多克隆抗體與經羊抗兔抗體及雙 鏈DNA共同修飾的金納米探針反應，變性得到單鏈DNA并將其收集，收集得到 的單鏈DNA一端與互補DNA修飾的金納米探針反應，另一端與生物素修飾的互 補DNA反應，并用親和素固定于酶標板上，加入異硫氰酸熒光素，用熒光酶標 儀檢測熒光信號從而檢測微囊藻毒素-LR含量；

將收集的單鏈DNA與10μL的生物素標記的捕獲探針25μM，5’-生物素 -a(10)TACGAGTTGAGACCGTTAAGACGA-3’混合，再加入含0.3M?NaCl， 0.02％SDS?pH7.420μL、0.01M?PBS，37℃孵育10分鐘后，再加入13nm金納米 探針20nM進一步雜交10分鐘后，將雜交液轉移到親和素包被的熒光酶標板上， 室溫孵育30分鐘，最后，用100μL?PBS緩沖液洗滌，加入100μL異硫氰酸熒 光素FITC，震蕩，熒光檢測，熒光強度可以通過Wallac1420工作站在線觀測。