[發(fā)明專利]一種氯硝西泮膠體金法檢測試紙及制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810022161.5
• 申請日: 2008-06-30
• 公開（公告）號: CN101315365A
• 公開（公告）日: 2008-12-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 胥傳來;李秋生;劉麗強;袁緩;彭池方;胡擁明
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: G01N33/52
• 分類號: G01N33/52;G01N33/558
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務(wù)所
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術(shù)領(lǐng)域

一種氯硝西泮膠體金法檢測試紙及制備方法，屬于生物學(xué)免疫方法的測定技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

氯硝西泮(Nitrazepam)為苯二氮卓類鎮(zhèn)靜安眠藥，化學(xué)名稱為：1，3-二氫-7-硝基-5-(2-氯-苯基)-2H-1，4-苯并二氮卓-2-酮。曾用作動物飼料添加劑，作為生長促進劑，具有使動物嗜睡少動，生長快且有改變?nèi)赓|(zhì)的作用。也用在屠宰和動物檢疫之前，或?qū)游镛D(zhuǎn)移屠宰之前，起鎮(zhèn)靜作用，以減輕動物緊張狀態(tài)，降低動物傷害和死亡率。此類藥物常見嗜睡，可見無力、頭痛、暈眩、惡心、便秘，偶見皮疹、肝損害、骨髓抑制等不良反應(yīng)。若隨意在飼料中添加此類藥物，蓄積的藥物通過食物鏈進入人體，將造成巨大的危害。為此許多國家將此類藥物列入禁用藥物名單。目前，國內(nèi)外有關(guān)氯硝西泮的檢測主要有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、薄層色譜法(TLC)、氣-質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS)、液-質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS)等，但這些方法不僅需要昂貴的儀器設(shè)備，對檢材的要求也比較高，需要進一步的提純處理才能進行，且不能適應(yīng)高通量、現(xiàn)場的快速檢測。因此實現(xiàn)具有快速，便攜優(yōu)點的免疫檢測方法的多殘留檢測具有現(xiàn)實意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種氯硝西泮膠體金法檢測試紙及制備方法，為了克服現(xiàn)有檢測技術(shù)的缺陷，提供一種便攜，快速適合進行現(xiàn)場檢測氯硝西泮的免疫層析色譜檢測法(gold?immunochromatography?assay；GICA)。

本發(fā)明的技術(shù)方案：一種氯硝西泮膠體金法檢測試紙，由樣品墊、結(jié)合釋放墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和塑料底板組成，塑料底板上依次粘貼樣品墊、結(jié)合釋放墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，結(jié)合釋放墊上包被了抗氯硝西泮多抗-膠體金標記物，硝酸纖維素膜上依次包被有氯硝西泮偶聯(lián)抗原和羊抗兔IgG抗體，以氯硝西泮偶聯(lián)抗原作為測試線，以羊抗兔IgG抗體作為質(zhì)控線。

制備步驟為：

(1)將氯硝西泮與牛血清蛋白分子進行偶聯(lián)，作為氯硝西泮偶聯(lián)抗原；

(2)用氯硝西泮偶聯(lián)抗原免疫獲得抗氯硝西泮多抗；

(3)用檸檬酸三鈉還原劑將氯金酸還原制成20nm-40nm膠體金顆粒；

(4)將3mL膠體金調(diào)至pH?9，攪拌下逐滴加入蛋白濃度為0.18mg/mL的抗氯硝西泮多抗0.015mL，放置30min后加入5％牛血清蛋白BSA溶液使終濃度為1％，放置至少30min后，10000轉(zhuǎn)離心50min，移去上清液后用含5％蔗糖的0.002mol/L?pH?9.0的硼酸鹽緩沖液3mL重懸，重復(fù)2次，最后用0.3mL緩沖液溶解，得到穩(wěn)定的抗氯硝西泮多抗-膠體金標記物；

(5)將抗氯硝西泮多抗-膠體金標記物包被在膠體金結(jié)合釋放墊上，將氯硝西泮偶聯(lián)抗原和羊抗兔IgG抗體依次分別包被在硝酸纖維素膜上，氯硝西泮偶聯(lián)抗原作為測試線和羊抗兔IgG抗體作為質(zhì)控線，在37℃烘箱干燥；

(6)試紙條的組裝：將樣品墊、結(jié)合釋放墊、硝酸纖維素膜、吸水墊由一端依次黏附在塑料底板上，即得到用于免疫檢測的氯硝西泮膠體金法檢測試紙。

本發(fā)明檢測原理是利用樣品墊形成的毛細管虹吸效應(yīng)，使被檢測物質(zhì)首先與膠體金標記的抗氯硝西泮多抗發(fā)生競爭形式的結(jié)合，其后果是，當膠體金標記的抗氯硝西泮多抗過量時，多余的多抗漂移到測試線，與氯硝西泮偶聯(lián)抗原結(jié)合并顯色；而與檢測物結(jié)合的膠體金標記的抗氯硝西泮多抗，其V區(qū)結(jié)合位點被檢測物質(zhì)占據(jù)，只能跨越測試線漂移到質(zhì)控線以C區(qū)位點與羊抗兔IgG抗體非特異性結(jié)合，同測試線進行比色而得到檢測結(jié)果。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明應(yīng)用層析式一步競爭法原理，試紙中上下線比色來半定量檢測血清或尿液樣品中的氯硝西泮殘留量，在5-10min內(nèi)，快速準確地檢測出樣品是否含有氯硝西泮，以確定氯硝西泮是否超標，能夠滿足食品安全對氯硝西泮殘留量檢測需求，適用于屠宰企業(yè)及政府檢測機構(gòu)。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其效果不言而喻，即具有使用方便、經(jīng)濟快捷、制作容易、成本低廉的特點。

附圖說明

圖1本發(fā)明氯硝西泮膠體金法檢測試紙的側(cè)視圖。

具體實施方式

實施例1：氯硝西泮檢測試紙的制備

(1)將氯硝西泮與牛血清蛋白分子偶聯(lián)，作為氯硝西泮偶聯(lián)抗原，

(2)用氯硝西泮偶聯(lián)抗原免疫獲得抗氯硝西泮多抗；

(3)用檸檬酸三鈉還原劑將氯金酸還原制成20nm-40nm膠體金顆粒；