[發明專利]一種定量檢測動物源食品中頭孢類抗生素含量的酶聯免疫檢測方法

無效

• 申請號: 200810022034.5
• 申請日: 2008-06-23
• 公開（公告）號: CN101315372A
• 公開（公告）日: 2008-12-03
• 發明（設計）人: 胥傳來;謝會玲;袁媛;趙金山;胡擁明
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N21/25
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

本發明涉及一種定量檢測動物源食品中頭孢類抗生素含量的酶聯免疫檢測方法，屬于免疫分析領域。

背景技術

頭孢類抗生素屬于β-內酰胺類抗生素。在畜類動物飼養中，β-內酰胺類抗生素廣泛用于控制奶牛的乳房炎，治療動物尿道、胃腸道和呼吸道感染等。但由于其使用方法不當或不遵守休藥期規定等原因，均可造成它在畜產品中的殘留，給人類健康帶來嚴重危害，如產生過敏反應、破壞胃腸道菌群平衡和增強細菌耐藥性等。因此其在乳制品中的殘留也越來越引起了國內外的重視。其中頭孢類抗生素由于具有抗菌譜廣等優點被廣泛用于人畜疾病的防治。且頭孢類抗生素種類繁多，現有的微生物檢測法和儀器檢測法很難實現對所有頭孢類抗生素進行快速、準確的檢測，有必要研究快速、便攜的多殘留免疫檢測技術。其中酶聯免疫檢測技術(ELISA)是目前能夠滿足上述檢測要求的用于定量的免疫檢測技術，且有望用本實驗室所獲得的具有簇特異性的抗頭孢類抗生素的多克隆抗體實現對至少三種頭孢類抗生素的多殘留檢測。

發明內容

本發明的目的是提供一種定量檢測動物源食品中頭孢類抗生素含量的酶聯免疫檢測方法，在于克服現有技術的不足，滿足對多種抗生素進行快速篩選的要求，提供一種快速，靈敏度高，檢測成本低廉的檢測動物源食品中頭孢類抗生素的酶聯免疫檢測方法。

本發明的技術方案：一種檢測動物源食品中頭孢類抗生素的酶聯免疫試劑盒，由試劑組和包被板構成；

試劑組的組成為：

(1)緩沖液：為pH?7.4磷酸鹽緩沖液，使用時用蒸餾水按1∶10稀釋；

(2)顯色液A：檸檬酸0.933g，磷酸氫二鈉3.68g，18μL雙氧水，用蒸餾水定容至100mL；

(3)顯色液B：60mg?3，3’，5，5’-四甲基對二氨基聯苯TMB溶于100mL乙二醇溶液；

(4)洗滌液：為含有5％吐溫-20的磷酸鹽緩沖液，使用時用蒸餾水按1∶10稀釋；

(5)終止液：為2mol/L的硫酸；

(6)凍干封閉液：Tris溶于雙蒸水中，鹽酸調節pH?7.4，加入0.2％的明膠；

(7)頭孢氨芐標準液：頭孢氨芐標準溶液濃度為10mg/mL，使用時用磷酸鹽緩沖液稀釋至100ng/mL，再稀釋至40ng/mL，10ng/mL，2ng/mL，0.1ng/mL，0.01ng/mL五個梯度；

(8)酶標記抗抗體：為辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗抗體，使用時按照1∶5000倍稀釋；

(9)基質掩蔽劑：含0.5％酪蛋白、pH?9.0-9.5、0.01M的磷酸鹽緩沖液；

包被板的構成為：

包被板為96孔或48孔酶標板，采用pH?9.6的碳酸鹽緩沖液作為包被緩沖液，用包被緩沖液將頭孢氨芐-BSA偶聯物稀釋至1/6400mg/mL作為包被液，在酶標板的每孔中加入100μL包被液，37℃烘箱放置2h或4℃過夜，用稀釋后的洗滌液洗滌三次，每次在吸水紙上拍干，然后加入凍干封閉液37℃烘箱放置2h，取出用稀釋后的洗滌液洗滌四次后，凍干，4℃保存。

所述定量檢測動物源食品中頭孢類抗生素含量的試劑盒的檢測方法，其特征在于：檢測步驟為：

(1)用3-5℃低溫離心進行樣品前處理，得到樣品提取液；

(2)分別將各種濃度的頭孢氨芐標準溶液和樣品提取液加入到包被板各自的微孔中，要雙孔平行加樣，然后在各微孔中加入酶標記的羊抗兔抗體即酶標二抗，混勻后37℃反應1-2h；

(3)酶標板取出后用稀釋后的洗滌液洗滌3-5次，最后一次洗滌后將酶標板在吸水紙上拍干，加入顯色液A與顯色液B的混合液，37℃反應20-40min；混合液中顯色液A與顯色液B的體積比為5∶1；

(4)取出后向各微孔中加入100μL終止液以終止反應，用酶標儀讀取吸光度值，根據不同濃度頭孢氨芐標準液的吸光值繪制頭孢氨芐的濃度-吸光值標準曲線圖，對照該標準曲線圖計算得到樣品中頭孢類抗生素的含量。

通過實驗確定其他種頭孢類抗生素的含量與頭孢氨芐標準品的含量的對應值，給出校準因子，從而實現對于其他種頭孢類抗生素的檢測。

所述的樣品前處理：樣品為動物組織，將樣品用勻漿器搗碎，均質，取適量均質后樣品加入萃取液，3-5℃低溫離心，取上清液用基質掩蔽劑稀釋；牛奶樣品：脫脂牛奶直接檢測，對于全酯牛奶則離心出去脂肪后進行檢測。

所用的萃取液為pH?7-8的磷酸鹽緩沖液。

檢測動物源食品中頭孢氨類抗生素含量的試劑盒所用的酶聯免疫檢測方法采用間接競爭酶聯免疫檢測法。