[發明專利]天然茶氨酸的制備方法

有效

• 申請號: 200810021187.8
• 申請日: 2008-08-19
• 公開（公告）號: CN101343618A
• 公開（公告）日: 2009-01-14
• 發明（設計）人: 江波;張濤;帥玉英
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N9/10;C12P13/02;C12R1/125
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

本發明涉及一種天然茶氨酸的制備方法，屬于生物工程技術領域。

背景技術

茶氨酸(N-乙基-γ-谷氨酰胺)是茶葉特有的一種氨基酸，是綠茶中有效的呈味物質，其含量直接決定茶葉的品質。此外，茶氨酸還具有降血壓、抗腫瘤、保護神經、放松、抗抑郁、抗疲勞、提高免疫力、減輕體脂等作用。因此，茶氨酸越來越受到人們的重視，并有望添加于食品和藥物中開發出新型的功能食品和功能藥物。

迄今為止，茶氨酸的制造方法，主要有三種。第一，是從茶葉中提取的方法。但由于干茶葉中的茶氨酸含量僅有1.5％左右，且光合作用會使茶氨酸損失一部分，致使產量很低。隨后，便發明了適合于工業化生產的第二種方法，即化學有機合成茶氨酸的方法。但該法可能會殘留毒性物質，且生成物包括D、L-型茶氨酸異構體，需要進行拆分才能得到L型產品，使得分離精制操作復雜。第三種制造方法，是利用微生物酶法進行生產。目前報道了利用來自假單孢菌屬的谷氨酰胺酶的γ-谷氨酰基轉移反應，由L-谷氨酰胺和乙胺合成茶氨酸的酶法和固定化酶法，以及2005年公開的利用來自香茅醇假單孢菌GEA和2007年公開的利用來自芽孢桿菌屬、霉菌或酵母菌中的1種或2種以上的谷氨酰胺酶酶法生產。但利用谷氨酰胺酶酶法生產存在著因谷氨酰胺酶的水解反應而在生產茶氨酸的同時，還生成副產物谷氨酸，而使茶氨酸的精制變得復雜的問題。

發明內容

本發明是鑒于上述問題而完成的發明，其目的在于提供有效的制備茶氨酸的方法。

本發明的技術方案：一株產生γ-谷氨酰轉肽酶的菌株，其分類命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)SK11.004，已保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號：CCTCC?NO：M208083。

一種天然茶氨酸的制備方法：

(1)制備粗酶粉：使用枯草芽孢桿菌SK11.004為出發菌株；

培養基，以g/L計為：蔗糖25、胰蛋白胨5、玉米漿15、MgSO₄·7H₂O0.5、K₂HPO₄1，pH7.0；37℃，200rpm的條件下培養16h；冷凍離心，制得的發酵液上清液，即為粗酶液；

將粗酶液進行濃縮后，按酶液:酒精體積比4:1的比例添加酒精進行沉淀，將沉淀后的蛋白冷凍干燥，即得粗酶粉；

(2)酶反應制備天然茶氨酸：使用制得的粗酶粉，以0.2U/mL加入到含谷氨酰胺0.02M、乙胺0.15-0.25M的pH9～10.5、100mM?Na₂B₄O₇-NaOH硼酸鈉緩沖液中，在35～40℃下進行2小時的酶反應，合成了茶氨酸；

(3)茶氨酸的精制：將酶反應液通過減壓濃縮除去乙胺后，再依次使用001×7的732強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂，201×7的717強堿性陰離子交換樹脂，和乙醇處理得到茶氨酸的精制品。

本發明的有益效果：發明人等為了解決上述問題，從中國傳統發酵制品中分離篩選得到一株新型的可用于生產茶氨酸的菌株，其所產的γ-谷氨酰轉肽酶，在pH9～10.5、35～40℃的條件下，通過作用于谷氨酰胺和乙胺，可以高效的生產茶氨酸，轉化率可達80％以上。

本發明的酶法制備茶氨酸的方法具有反應時間短、酶活性源制備簡單、能使茶氨酸的生產簡單，以及產品安全可靠的優點，適于進行大規模工業化生產。

生物材料樣品保藏

上述茶氨酸生產菌是本發明人等首次發現鑒定的新型菌株，分類命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)SK11.004，保藏機關名稱：中國典型培養物保藏中心，地址：中國武漢武漢大學，保藏日期：2008年07月10日，保藏編號：CCTCC?NO：M208083。

附圖說明

圖1用枯草芽孢桿菌SK11.004所產的γ-谷氨酰轉肽酶作用于谷氨酰胺和乙胺合成茶氨酸時的氨基酸測定結果。glu：谷氨酸，gln：谷氨酰胺，the：茶氨酸。

具體實施方式

下面，詳細說明本發明的實施方式，但本發明的技術范圍不受限于下述實施方式，在不改變其要點的前提下，可做各種改變進行實施。另外，本發明的技術范圍延及均等的范圍。

本發明的茶氨酸是指N-乙基-γ-谷氨酰胺，是茶葉特有的一種氨基酸，是綠茶中有效的呈味物質，可以用作品質、風味改良劑及功能食品添加劑。

本發明中使用的乙胺衍生物，可以列舉乙胺、乙胺鹽酸鹽等。