[發明專利]用于單細胞組學的方法

無效

• 申請號: 200810020732.1
• 申請日: 2008-02-22
• 公開（公告）號: CN101231262A
• 公開（公告）日: 2008-07-30
• 發明（設計）人: 肖忠黨;田田;王海濤;朱釗奇
• 申請（專利權）人: 東南大學
• 主分類號: G01N27/447
• 分類號: G01N27/447;G01N21/64;G01N13/16
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司
• 代理人: 葉連生

技術領域

本發明涉及一種用于單細胞組學的方法，對單細胞內容物進行雙向平面電泳，并應用AFM或高靈敏CCD進行檢測的方法，屬于蛋白質組學及細胞生物學等領域。

背景技術

如今，人類基因組計劃(Human?Genome?Project)已經取得了巨大的成功，許多物種的基因組測序都已完成，但僅僅靠基因組的序列來試圖闡明生命現象還遠遠不夠。因此，研究的重心從揭示分子水平的遺傳信息轉移到了細胞水平的功能與調控上來。生命科學已經跨入了后基因組時代，即蛋白質組時代。蛋白質組(proteome)是指一個細胞在特定生理或病理狀態下表達的所有種類的蛋白質。蛋白質組學(proteomics)是指研究蛋白質組的技術及這些研究所得到的結果，其內容包括蛋白質鑒定、翻譯后修飾、蛋白質功能確定與疾病的關系。蛋白質組學是連接基因、蛋白質和疾病的紐帶，對蛋白質表達的變化或差異的分析將具有重要的生物學意義和醫學應用價值，為闡明生命現象的本質奠定基礎。二維凝膠電泳(2-dimension?electrophoresis)——質譜(mass?spectrometry)是目前研究蛋白質組學最流行和可靠的技術平臺。其一般過程是：細胞或組織培養，樣品制備，二維凝膠電泳分離蛋白質，染色，計算機輔助分析電泳圖象，對感興趣蛋白進行酶解，質譜分析，數據庫檢索，蛋白質鑒定，分析蛋白質在細胞和組織中的表達情況。二維凝膠電泳技術早在1975年就由O’Farrell建立起來，包括第一維上的pH等電聚焦和第二維上的SDS凝膠電泳，使蛋白質分別按不同的等電點和荷質比進行分離。但凝膠電泳在靈敏度上有著先天的局限性，銀染條件下的最小檢出量只有0.1ng。隨著蛋白質組學研究的深入，研究單個細胞的全部蛋白，特別是低豐度蛋白成了目前亟待解決的關鍵問題。但是單個細胞的蛋白量遠遠達不到一般電泳的上樣量，重要的低豐度蛋白質分子根本無法檢出，或者被大量表達的蛋白將其覆蓋。目前，人們發展了精度更高的二維色譜(2D-LC)，二維毛細管電泳(2D-CE)，液相色譜-毛細管電泳(LC-CE)等新型分離技術來應對這一蛋白質組學中的關鍵問題，但都存在操作復雜費時，效率低，無法獲得蛋白間相互作用等多維信息的問題。

原子力顯微鏡(AFM)發明于上世紀80年代，具有原子級分辨能力和納米級操縱能力，是在納米尺度和單分子級別進行表征和操縱的重要工具，特別適用于在原有生物環境中對生物大分子的結構和力學性質進行分析。目前，應用AFM在固體-液體界面觀察蛋白質、核酸、多糖等生物大分子的長度、形狀、體積、微結構，并對它們進行針尖-分子、分子-分子間相互作用力的測量，以及拉伸、切割、移動等操縱的技術已十分成熟。AFM操作簡單，無需染色，所得信息真實、多樣，完全滿足單細胞蛋白質組學的研究要求。但AFM檢測要求在平坦的基底上進行，樣品與基底間要有一定作用力，溶液中也不能有干擾針尖的雜質存在。而傳統的二維電泳是在凝膠中進行的，不適合AFM即時檢測。因此，至今國內外還沒有二維電泳與AFM檢測相結合的相關報道。

高靈敏CCD技術的發展使單分子熒光檢測越來越便捷和高效。EMCCD(Electron?Multiplying?CCD)技術是一種全新的微弱光信號增強探測技術，由Andor?Technology?Ltd.首先應用于2001年發布的iXon系列高端超高靈敏相機上。該技術在固體成像器件中嵌入可控的電荷雪崩倍增寄存器，使信號電荷在讀出過程中得到雪崩增強，具有是高量子效率、高靈敏度、高信噪比、高空間分辨率、高讀出速率、高幀速工作和可變的增益控制等特點，克服了傳統ICCD(Intensified?CCD)背景噪聲大、光電效率低等諸多缺點。EMCCD在對極微弱光信號的實時快速動態檢測方面具有先天優勢，其靈敏度可達到真正的單光子水平，非常適合單分子熒光檢測。

發明內容

技術問題：本發明的目的是對現有雙向電泳技術進行改進，提供一種用于單細胞組學的方法，使其在單細胞水平上進行，并與AFM或高靈敏CCD檢測結合，實現單分子層次上的檢測?？捎糜诘鞍踪|組學及細胞生物學等領域。