[發(fā)明專利]重組豬α型干擾素的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810020180.4
• 申請日: 2008-03-28
• 公開（公告）號: CN101289666A
• 公開（公告）日: 2008-10-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王明麗
• 申請（專利權(quán)）人: 王明麗
• 主分類號: C12N15/21
• 分類號: C12N15/21;C12N15/70;C07K14/56;C07K1/14
• 代理公司: 安徽合肥華信知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 余成俊

1.重組豬α型干擾素的制備方法，其特征是進(jìn)行以下步驟：

(1)、構(gòu)建克隆載體

目的基因?yàn)椋?/p>

TCACTCCTTCTTCCTGAGTCTGTCTTGCAGGTTTGTGGAGGAAGAGAAGGCTCTCATGACTTCTGCCCTGACGATCTCCCAGGCACAGGGGCTGTAGCTCTTCTCTTGCAGATAGAGGGTGAGTCTGTGGAAGTATTTCCTCACAGCCAGGATGGAGTCCTCCTCCAGCAGGGGGGTCCCTTCCAGCCCGGCCTCCTGCATGACACAGGCTTCCAGGTCCCTGAGCTGCTGATCCAGTCCAGTGCAGAACTGGTGCAGGAGGCTCTCATCCCAGGCAGCAGCCGAGCCCTCTGTGCTGAAGAGCTGGAAGGTCTGCTGGAGCATCTCATGCACCAGAGCCATGGCTTGAGCCTTCTGGACCTGGTTGCCCCCCAAGGCCTCTTGGAATCCAAAGTCCCTTCTGTGGTCCAGGCAGGAGAAGGGGGAGATTCTCCTCATTTGTGCCAGGAGCCTCAGGGCCCTGGTGTGAGCCAGGCTGTGGGTCTGAGGCAGGTCGCA

特異性引物：上游：GAATTC?TGCGAC?CTGCCT?CAGACC?CA

????????????下游：CTCGAG?TCACTC?CTTCTT?CCTGAG?TC

克隆載體：pMD18-T?simple?vector

(2)、構(gòu)建表達(dá)載體

表達(dá)載體：pET-28a，或者pGEX-5X

(3)、重組蛋白的表達(dá)

挑取載體構(gòu)建成功的重組表達(dá)菌進(jìn)行擴(kuò)增、放大培養(yǎng)，并加入誘導(dǎo)劑低溫誘導(dǎo)表達(dá)；

(4)、鑒定重組蛋白

應(yīng)用抗α型干擾素參考血清做中和實(shí)驗(yàn)，證明型別無誤；

(5)、純化重組蛋白，得到粗制品干擾素。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組豬α型干擾素的制備方法，其特征在于具體步驟為：

(1)、構(gòu)建克隆載體

目的基因：

TCACTCCTTCTTCCTGAGTCTGTCTTGCAGGTTTGTGGAGGAAGAGAAGGCTCTCATGACTTCTGCCCTGACGATCTCCCAGGCACAGGGGCTGTAGCTCTTCTCTTGCAGATAGAGGGTGAGTCTGTGGAAGTATTTCCTCACAGCCAGGATGGAGTCCTCCTCCAGCAGGGGGGTCCCTTCCAGCCCGGCCTCCTGCATGACACAGGCTTCCAGGTCCCTGAGCTGCTGATCCAGTCCAGTGCAGAACTGGTGCAGGAGGCTCTCATCCCAGGCAGCAGCCGAGCCCTCTGTGCTGAAGAGCTGGAAGGTCTGCTGGAGCATCTCATGCACCAGAGCCATGGCTTGAGCCTTCTGGACCTGGTTGCCCCCCAAGGCCTCTTGGGGAATCCAAAGTCCCTTCTGTGGTCCAGGCAGGAGAAGGGGGAGATTCTCCTCATTTGTGCCAGGAGCCTCAGGGCCCTGGTGTGAGCCAGGCTGTGGGTCTGAGGCAGGTCGCA

特異性引物序列：上游：GAATTC?TGCGAC?CTGCCT?CAGACC?CA

????????????????下游：CTCGAG?TCACTC?CTTCTT?CCTGAG?TC

用特異性引物PCR擴(kuò)增豬α型干擾素的目的基因后，將目的基因克隆于pMD18-T?simple?vector至并轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌涂LB培養(yǎng)基平板進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，取白色樣的克隆菌進(jìn)行目的基因PCR驗(yàn)證，同時(shí)進(jìn)行雙酶切鑒定，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將PCR和雙酶切均陽性質(zhì)粒進(jìn)行目的基因測序；

(2)、構(gòu)建表達(dá)載體

鑒定后選擇與目的基因一致的克隆菌進(jìn)行雙酶切后，與表達(dá)載體pET-28a或者pGEX-5X進(jìn)行連接，并相應(yīng)轉(zhuǎn)化至BL-21大腸桿菌，分別進(jìn)行培養(yǎng)，鑒定出表達(dá)載體構(gòu)建成功的重組表達(dá)菌；

(3)、重組蛋白的表達(dá)

分別挑取與pET-28a或者pGEX-5X表達(dá)載體連接的重組表達(dá)菌進(jìn)行小量擴(kuò)增、放大培養(yǎng)，加入異丙基硫代半乳糖苷IPTG，低溫誘導(dǎo)表達(dá)，收集細(xì)菌；

(4)、鑒定重組蛋白

應(yīng)用抗α型干擾素參考血清做中和實(shí)驗(yàn)，證明型別無誤；

(5)、純化重組蛋白，得到粗制品干擾素。