[發明專利]一種耐有機溶劑蛋白酶高產菌以及該耐有機溶劑蛋白酶的基因和應用

有效

• 申請號: 200810019698.6
• 申請日: 2008-03-12
• 公開（公告）號: CN101240254A
• 公開（公告）日: 2008-08-13
• 發明（設計）人: 何冰芳;歐陽平凱;唐嘯宇;何小丹;潘瑤;姚忠;柏中中
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N9/52;C12N15/57;C12P21/00;C12R1/385
• 代理公司: 南京知識律師事務所
• 代理人: 汪旭東

技術領域

本發明涉及一種耐有機溶劑蛋白酶高產菌，其耐有機溶劑蛋白酶的基因，以及該耐有機溶劑蛋白酶在有機相中催化肽合成的應用，屬于微生物學與酶學領域。

技術背景

蛋白酶是指能催化肽鍵水解的一類酶，自1913年被試驗用于洗滌劑的添加成分以來，由于其重要的商業價值而被廣泛關注。由于巨大的市場需求，蛋白酶逐漸成為三大工業用酶之一。當今蛋白酶的產量已經占據酶市場的40％以上，廣泛應用于洗滌劑、食品、醫藥、皮革、有機合成、廢物處理等領域。蛋白酶雖然廣泛存在于幾乎所有生物中，但由于微生物生產的蛋白酶主要是胞外酶，與動、植物來源的蛋白酶相比更適合工業化，所以微生物來源的蛋白酶的產量占目前蛋白酶總產量的2/3以上。

蛋白酶催化的最普通的反應是水解蛋白質中的肽鍵。通常情況下，蛋白酶催化水解肽鍵的反應是在特定的pH的緩沖溶液中進行的，而且蛋白酶對其所催化肽鍵的氨基酸殘基具有特異性要求，即有著高度的區域選擇性和立體選擇性。隨著酶工程和溶劑工程技術的發展，人們發現蛋白酶在有機溶劑中能夠催化一些水溶液中不能進行的反應，比如：在非水條件下，蛋白酶能催化肽鍵的形成。大量的研究表明，有機溶劑中進行酶促反應有著許多的優點：1、增大各種有機底物的溶解度；2、具有高度的立體選擇性和區域選擇性，有機介質可改變選擇性；3、控制反應平衡向所需方向移動，如水解酶在有機介質中能催化脫水縮合反應；4、有效防止微生物污染，產物易于分離純化等。這使得有機溶劑中的酶反應越來越多的運用到實際中。如甜味劑Aspartame的前體物的合成，該反應以嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)為催化劑，在雙相中合成前體二肽，含有底物(Z-L-Asp和L-PheOMe)的有機相被連續添加到反應器中，底物被連續萃取到含有酶的水相中，并在水相中合成前體二肽，然后二肽再被萃取到有機相中，使反應連續進行；再如在精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)的短肽的合成中，先用胰蛋白酶在含有0.1M?Tris/HCL緩沖溶液中(PH＝8.0)的極性有機溶劑乙醇中催化Bz-Arg-OEt和H-Gly-OEt生成Bz-Arg-Gly-OEt，再用木瓜凝乳蛋白酶在0.25M?CHES/NaOH緩沖液(PH＝9.0，EDTA?10mM)的乙醇溶液中催化Bz-Arg-Gly-OEt和H-Asp(-OMe)₂生成Bz-Arg-Gly-Asp(-OMe)OH，兩步的產率分別為80％和70％，整個合成過程總共有8步，分別是：三種氨基酸的酯化、N端氨基酸的保護與取保護、兩步酶催化的肽合成、最后一步酯水解；而化學合成方法卻需要9～10步分別為：兩種自由氨基酸的酯化、N端氨基酸的保護與取保護、Arg中胍基的保護與去保護、兩步肽鍵合成反應、兩步酯水解反應，如果副反應過多可能還要加上最后的提純步驟，而胍基的保護和去保護由于成本過高，是化學合成中是盡量避免的。

酶催化的有機相反應體系一般分三類：1、水-疏水有機溶劑雙相體系，酶溶解于水相，底物或產物則溶解于有機相，底物部分進入水相或在界面處與酶作用，此體系中底物的擴散與傳質限制了酶反應速度。2、疏水有機溶劑單相體系，酶粉懸浮于有機溶劑中，為維持酶分子表層的“必需水”，避免采用極性有機溶劑；底物的擴散速率也是該體系的限制步驟。3、水-極性有機溶劑互溶體系，酶與底物存在于均一體系中具有很高的反應效率。三種體系中有機溶劑均對酶產生影響，酶易變性失活。特別是極性有機溶劑互溶體系，一般親水有機溶劑的比例為10％～30％，高于某閾值的親水有機溶劑就會奪去酶分子表面的結構水，而導致酶失活。

有機溶劑體系中酶催化的誘人前景與酶易失活的矛盾推動了酶的改造與非水酶學的發展。過去20多年，研究者致力于提高酶在有機溶劑中的穩定性，常用方法：1、使用疏水性有機溶劑作為反應介質并控制介質中的含水量，以保證酶的“必需水”；2、在反應介質中加入保護劑甘油、乙二醇、多元醇聚合物等，或加入環糊精等冷凍干燥保護劑，以提高酶分子在有機介質中的穩定性。3、利用固定化、包埋法、大分子修飾等理化修飾方法提高酶在有機介質中的活性和穩定性；4、利用基因改造提高酶的有機溶劑穩定性；然而上述方法只能在一定程度上改善酶在有機溶劑中的活性和穩定性。