[發(fā)明專利]一種發(fā)酵與膜分離單元耦合制備丁二酸的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810019287.7
• 申請日: 2008-01-18
• 公開（公告）號: CN101215583A
• 公開（公告）日: 2008-07-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 姜岷;吳昊;韋萍;左鵬;雷丹;陳可泉;姚忠
• 申請（專利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12P7/46
• 分類號: C12P7/46;C12R1/01
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所
• 代理人: 柏尚春

1.一種發(fā)酵與膜分離單元耦合制備丁二酸的方法，其特征在于該方法包括如下步驟：

(1)制備產(chǎn)丁二酸菌株的發(fā)酵種子；

(2)制備發(fā)酵培養(yǎng)基；

(3)將發(fā)酵培養(yǎng)基裝入發(fā)酵罐，再將發(fā)酵種子接入發(fā)酵罐；

(4)前期厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸；

(5)使部分發(fā)酵液流出發(fā)酵罐，同時流加發(fā)酵培養(yǎng)基以保持發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液體積恒定；

(6)發(fā)酵罐內(nèi)的發(fā)酵液繼續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸；同時流出發(fā)酵罐的發(fā)酵液先經(jīng)過微濾或超濾單元，再經(jīng)過納濾單元，被微濾或超濾單元截留的菌體細(xì)胞與組分返回發(fā)酵罐內(nèi)，被納濾單元截留的發(fā)酵液中未消耗的底物也返回發(fā)酵罐，收集納濾膜滲透液。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵與膜分離單元耦合制備丁二酸的方法，其特征在于步驟(1)中所述的產(chǎn)丁二酸菌株為產(chǎn)琥珀酸放線桿菌Actinobacillus?succinogenes。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵與膜分離單元耦合制備丁二酸的方法，其特征在于步驟(1)中所述的制備發(fā)酵種子的方法由如下步驟組成：

a、種子培養(yǎng)基的制備：種子培養(yǎng)基為pH?6.0～7.0的含有糖類的能提供碳源、氮源及無機鹽的常規(guī)液體培養(yǎng)基；斜面培養(yǎng)時，種子培養(yǎng)基內(nèi)再添加瓊脂；其中糖類為葡萄糖、阿拉伯糖、木糖或甘露糖中的一種或多種；氮源為有機或無機含氮化合物，其中無機含氮化合物為乙酸銨或氯化銨中的一種或多種，有機含氮化合物為蛋白胨、酵母膏、玉米漿或牛肉膏中的一種或多種；無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、磷酸鹽、錳鹽或鐵鹽中的一種或多種；

b.斜面培養(yǎng)：將產(chǎn)丁二酸菌株在斜面培養(yǎng)基中進行平板劃線后，在厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱通入含有N₂、CO₂和H₂的混合氣體，N₂、CO₂和H₂的體積比為8∶1∶1，溫度為30～40℃，培養(yǎng)24～48h，用于種子培養(yǎng)基接種和菌株保存；

c.發(fā)酵種子培養(yǎng)：每100mL血清瓶中種子培養(yǎng)基的用量為20～80mL，通入含有N₂、CO₂的混合氣體，N₂、CO₂的體積比為4∶1，115～121℃滅菌15～30min，冷卻后接入產(chǎn)丁二酸菌種，培養(yǎng)溫度為30～40℃，轉(zhuǎn)速100～200r/min，發(fā)酵時間為10～14h，作為發(fā)酵種子。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵與膜分離單元耦合制備丁二酸的方法，其特征在于步驟(2)所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為pH?6.0～7.0的含有糖類的能提供碳源、氮源及無機鹽的常規(guī)液體培養(yǎng)基，并添加維生素；其中糖類為葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖或生物質(zhì)水解糖液中的一種或多種；氮源為有機或無機含氮化合物，其中無機含氮化合物為乙酸銨或氯化銨中的一種或多種，有機含氮化合物為蛋白胨、酵母膏、玉米漿或牛肉膏中的一種或多種；無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、磷酸鹽、錳鹽或鐵鹽中的一種或多種；維生素為葉酸、生物素、維生素B₁₂、硫辛酸、煙酸、泛酸、硫胺素或維生素B₆中的一種或多種。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵與膜分離單元耦合制備丁二酸的方法，其特征在于步驟(3)中，每5L發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)基體積為2～4L，丁二酸發(fā)酵種子的接種體積占培養(yǎng)基體積的3～7％。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵與膜分離單元耦合制備丁二酸的方法，其特征在于步驟(4)所述的厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法為：溫度35～40℃，發(fā)酵罐通入CO₂氣體，通氣量為0.75～1.5L/min，攪拌轉(zhuǎn)速100～300rpm，發(fā)酵過程采用碳酸鈉、氨水、氫氧化鈉、硫酸或鹽酸，控制體系的pH在6.0～7.5，進行前期厭氧發(fā)酵10～15h。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵與膜分離單元耦合制備丁二酸的方法，其特征在于步驟(5)采用半連續(xù)方式，每隔4～6h，將40～67％的發(fā)酵液分離出發(fā)酵罐，同時向發(fā)酵罐內(nèi)補充發(fā)酵培養(yǎng)基，保持發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液體積恒定。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵與膜分離單元耦合制備丁二酸的方法，其特征在于步驟(5)采用連續(xù)方式，以0.1～0.8h^-1的稀釋速度流加發(fā)酵培養(yǎng)基，同時排出發(fā)酵液，保持發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液體積恒定。