[發明專利]赤松(Pinus densiflora)組織培養增殖方法

有效

• 申請號: 200810019270.1
• 申請日: 2008-01-18
• 公開（公告）號: CN101485291A
• 公開（公告）日: 2009-07-22
• 發明（設計）人: 吳小芹;朱麗華;葉建仁;戴培培
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體是指赤松組織培養增殖方法。

背景技術

松屬(Pinus)是針葉樹各屬中最大也是最重要的一個屬，大約有116個種以及變種和雜種，在世界上分布、種植極為廣泛，不僅在世界木材、松脂及造紙等方面有突出貢獻，而且在生態系統中具有非常重要的地位。由于受各種病蟲害的危害，每年均有大量松樹枯死，其中，受松材線蟲病(Bursaphelenchus?xylophilus)危害最為嚴重。該病目前已導致日本松林總面積266萬hm²中的45萬hm²發病，損失十分慘重。在我國，因松材線蟲病造成枯死的松樹累計已達5000萬余株，直接經濟損失25億元，間接經濟損失達250億元，且還在以每年6000hm²的速度擴散蔓延，對林業生產、森林資源和生態環境造成了嚴重的破壞。

赤松為松屬的一個種，分布于我國華東及北部沿海地區以及日本、朝鮮、蘇聯。通常被栽植為建筑用材、制漿用材或庭蔭樹、行道樹、防潮林、風景林。該樹種是最容易感染松材線蟲病的樹種之一。在日本，由于受松材線蟲的嚴重危害，赤松大量枯死。在中國、韓國，赤松同樣受到松材線蟲病的嚴重威脅。為了挽救瀕危的鄉土樹種，日本林業工作者通過在病害嚴重發生地選育抗病單株等方式建立了赤松抗病種子園。然而，抗病種子產量非常有限，難以滿足大規模林業生產的需要。為此，迫切需要尋求能夠快速、大量繁殖現有抗病材料的有效途徑。

植物組織培養作為一種可替代的無性繁殖方法，在農作物、花卉及速生樹種例如桉樹的良種繁育中得到了廣泛的應用，在許多針葉樹中亦被證明是可行的。據初步統計，到目前為止，各國學者已對松屬的60多個種或變種、雜種進行了組織培養，近40個獲得了再生成植株，其中我國學者沈熙環、黃健秋等對松屬的15個種進行了研究，8個種獲得了再生植株。盡管松屬樹種的組織培養倍受各國學者重視，但是由于難度較大，現有的組織培養方法中存在增殖系數低、玻璃化現象嚴重、難以長期繼代培養等問題，使眾多研究僅停留于植株再生過程的完成，而對中間繁殖體的長期繼代、大量增殖少有研究，造成能實現產業化生產的樹種鳳毛麟角。

有關赤松組織培養的報道較少。Isikawa(1987)研究了赤松下胚軸和幼苗根尖的器官分化情況，僅在胚軸上發現有不定根的形成；Choi等(1993)對赤松幼苗器官發生進行了研究，獲得少量完整植株；Maruyama等(2005)、Shoji等(2006)分別用未成熟胚誘導出體細胞胚胎，并獲得再生植株，但存在胚性愈傷誘導率、體胚轉化率極低等問題。目前國內尚未有關于赤松組織培養形態發生的報道。

發明內容

發明目的：本發明主要針對抗松材線蟲病赤松成熟種子珍貴而稀少、且赤松組織培養增殖系數低、大量擴繁難的問題，研究發明一種赤松組織培養增殖方法，以滿足社會生產需要。

技術方案：一種赤松組織培養增殖方法，包括以下步驟：

1、將赤松無菌萌發3～4周的幼苗子葉節(含子葉及剛萌動的上胚軸和6～8mm下胚軸)接種于含有6-芐基嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)的基本培養基GD(Gresshoffand?Doy?medium，1972)上，誘導子葉基部產生叢生芽；

2、將外植體連同已分化的叢生芽轉入含有活性炭(AC)或NAA的基本培養基DCR(Guptaand?Durzan?medium，1985)中，促進叢生芽伸長；

3、選取生長健壯、長1.5～2.0cm的叢生芽單個切割下來，切去莖尖生長點并將其切割成長5～8mm的小段，接種至含有6-BA和NAA的基本培養基GD中，誘導叢生芽增殖。

步驟3增殖產生的叢生芽再轉入步驟2所述的培養基中促進其伸長，然后重復步驟3，循環往復，可獲得大量叢生芽，從而實現叢生芽的大量增殖。步驟2、步驟3繼代周期各為4～5周。

以上各步驟培養條件為：溫度23～25℃，光照強度2000?Lux，每日光照16h。

其中，在步驟1中所述誘導子葉基部產生叢生芽的培養基中6-BA的濃度為3.0～5.0mg/L，NAA的濃度為0.1～0.3mg/L。

在步驟2中當將外植體連同已分化的叢生芽接入含有AC的DCR培養基上時，AC的濃度為0.5～1.5g/L；接入含有NAA的DCR培養基上時，NAA的濃度為0.1～0.3mg/L。

在步驟3中所述誘導叢生芽增殖的培養基中6-BA的濃度為1.5～2.5mg/L，NAA的濃度為0.25mg/L。