[發明專利]新構建的高產富馬酸基因工程菌及其生產富馬酸的方法

無效

• 申請號: 200810019216.7
• 申請日: 2008-01-16
• 公開（公告）號: CN101240259A
• 公開（公告）日: 2008-08-13
• 發明（設計）人: 姜岷;馬江鋒;王益娜;于麗;黃秀梅
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/09;C12P7/46;C12R1/19
• 代理公司: 南京知識律師事務所
• 代理人: 汪旭東

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，涉及一株產富馬酸重組菌株的構建，還涉及利用該菌株發酵生產富馬酸的方法。

背景技術

富馬酸(又稱延胡索酸)作為一種重要的四碳平臺化合物，在醫藥、食品以及表面活性劑等行業有著廣泛的用途，可以通過酶催化轉化、酯化、加氫等工藝生產L-天冬氨酸、蘋果酸、琥珀酸、馬來酸、1，4-丁二醇、γ-丁內酯和四氫呋喃等四碳化合物。目前富馬酸主要通過順丁烯二酸酐異構化和糠醛氧化法生產，化學合成富馬酸因成本高和環境污染等原因使得富馬酸作為基本化工原料的廣泛應用受到限制。

富馬酸的生物合成法具體包括酶催化轉化法和微生物發酵法。20世紀90年代中期出現的酶催化轉化法一般都是以馬來酸為底物，在馬來酸異構酶作用下制備富馬酸，但原料馬來酸供應不足，且價格昂貴。20世紀70年代石油危機的出現，使得人們加大了對微生物發酵法制備富馬酸的研究力度，這一時期人們用來發酵制備富馬酸的微生物有霉菌、酵母及細菌。其中根霉菌Rhizopus為重點研究的對象，具體包括米根霉Rhizopusoryzae、少根根霉Rhizopusarrhizus以及黑根霉Rhizopusnigricans等。在這一時期，我國科學家對微生物發酵法生產富馬酸的研究工作也進行了一定的探索，其中山西微生物研究所的白照熙等篩選出了具有產富馬酸能力的少根根霉，當振蕩培養于含有12％葡萄糖的培養基時，富馬酸產量為53.15g/L，得率為45％，同時產生了較多的副產物如蘋果酸等，但發酵周期較長，需要11天左右(食品與發酵工業，1988)。美國Purdue大學的Tsao教授等利用米根霉發酵產富馬酸，98g/L初始葡萄糖發酵48h，其富馬酸產量為33g/L，得率為33.7％(Bioprocess?Biosyst?Eng，2002，25：179～181)。

發酵法生產富馬酸可以利用可再生資源和二氧化碳，不僅擺脫了對石化原料的依賴，而且開辟了溫室氣體二氧化碳利用的新途徑。因此，以微生物發酵法生產富馬酸的研究與開發正在美國、日本等國家深入地進行著。但霉菌生長速度慢，產品生產強度偏低。開發對營養條件需求簡單、生長迅速、收率高的C4有機酸生產菌株是加速生物法替代石化法生產的關鍵。

利用大腸桿菌來發酵生產富馬酸，是利用了大腸桿菌生長快速、生長周期短、培養條件簡單、安全性好、價格低廉等諸多優點，實現富馬酸優質高產工業化生產的方向。而提高大腸桿菌的發酵產酸能力，可以用多種方法，包括重新篩選優良菌株、通過傳統的物理化學方法進行菌種誘變以及用現代遺傳育種技術、基因工程方法來提高菌種的產酸能力等。Soon?Ho?Hong等人報道了構建產琥珀酸基因工程菌的方法，原理是敲除野生大腸桿菌中的丙酮酸甲酸裂解酶基因(PFL)和乳酸脫氫酶基因(LDH)，減少甚至不產副產物甲酸、乳酸、乙酸以及乙醇等，使更多的代謝流流向琥珀酸(Biotechnol?Bioeng，2001，74：89～95)。在此基礎下，如果能夠敲除FRD，則可以阻斷最后一步富馬酸到琥珀酸的反應，使產物以富馬酸的形式積累。

采用基因工程手段構建高產富馬酸的大腸桿菌菌以及利用該基因工程菌用于厭氧發酵生產富馬酸的方法未見公開，而這種應用將大大推進富馬酸產業的進步和發展。

發明內容

本發明的目的在于提供一種能高產富馬酸的基因工程菌株及其構建方法，并利用該菌株厭氧生產富馬酸，達到菌株的構建方法簡單方便，構建得到的菌株發酵方法簡單可行，易于工業化，產酸能力強，從而大大降低生產成本，提高經濟效益。

為實現本發明目的，本發明采用以下技術方案：

1、高產富馬酸基因工程菌株Escherichia?coli?JM125的構建

本發明構建到的基因工程菌株，分類命名為埃希氏菌屬大腸埃希氏菌Escherichiacoli?JM125，其保藏號登記號為CGMCC?No.2301。

本發明以缺乏乳酸脫氫酶基因(LDH)，丙酮酸甲酸裂解酶基因(PFL)活性的菌株NZN111為出發菌株，利用同源重組技術敲除富馬酸還原酶FRD基因，并過量表達蘋果酸酶后，恢復其在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力，獲得Escherichia?coli?JM125，重組菌株的代謝途徑如圖1所示。具體步驟如下：

(1)利用同源重組技術敲除富馬酸還原酶FRD基因：

本發明以兩側帶有FRT位點的安普霉素抗性基因為模板，利用高保真PCR擴增系統，并設計兩端帶有FRD同源片段的擴增引物，成功擴增出線性DNA同源片段；