[發明專利]一種肝素親和柱及其制備方法和應用

無效

• 申請號: 200810018999.7
• 申請日: 2008-02-02
• 公開（公告）號: CN101306353A
• 公開（公告）日: 2008-11-19
• 發明（設計）人: 張春妮;王相棟;汪俊軍;李克
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍南京軍區南京總醫院
• 主分類號: B01J20/286
• 分類號: B01J20/286
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司
• 代理人: 夏平;劉成群

技術領域

本發明涉及一種肝素親和柱及其制備方法和應用。

技術背景

肝素是一類糖胺聚糖，由糖醛酸和葡萄糖胺以1→4鍵連接起來的重復二糖單位組成的多糖鏈的混合物；可以作為親和色譜與離子交換色譜的有效配體。其可以親和許多生物分子，包括凝血因子和其它血漿蛋白如：脂蛋白、蛋白合成因子、核酸酶以及固醇類激素受體。2-O-硫酸-α-L艾杜糖醛酸及6-O-硫酸N-硫酸-α-D葡萄糖胺是其中的主要單糖，由它們組成的三硫酸二糖的重復單位構成了肝素的所謂“規則區”，是肝素結構的主要部分，另外的單糖殘基以很低的頻率出現于“非規則區”。成品肝素中，只有三分之一的肝素分子能與A?T?III結合，這些結合的部分具有抗凝活性，而其余部分則活性很低。研究發現，肝素加速抗凝血酶-絲氨酸蛋白酶反應依賴于一個獨特的五糖序列。

肝素親和柱目前主要由國外Pharmacia公司生產，技術一直沒有公布。國內外也有文獻報道過多種肝素親和柱的制備方法。最經典的是用溴化氰活化瓊脂糖后連上肝素(如Phamacia公司的heparin?sepharose?CL?6B產品)，但此方法因溴化氰有劇毒而不宜在實驗室中進行，并且形成的化學鍵易斷裂，肝素的活性受偶聯的影響也比較大。國內有人將瓊脂糖環氧化后直接連接肝素，并用之成功分離純化了肝生長因子，但這種偶聯方式的產品在醇類溶液中不穩定。用還原胺化的方法將肝素偶聯上瓊脂糖類介質是比較理想的一種方法，原因是還原胺化法偶聯的是肝素的末端醛基與胺化瓊脂糖上的胺基，不影響肝素的活性中心，從而可以保證所得產品具有較高的親和性能。國外早在1983年就有人用3種方法將肝素聯上瓊脂糖進行對比，3種方法中以還原胺化法消耗的肝素量最少，但親和能力最高；然而當時的方法也有一定的缺陷，就是還原劑氰基硼氫化鈉的反應產物有劇毒，對環境有污染以及反應周期長達16天等。國內近期也有人采用不同的方法法制備了肝素瓊脂糖凝膠6FF親和柱(非間接還原胺化)，成功分離純化了抗凝血酶III(Antithrombin?III，AT?III)。

發明內容

本發明的目的是提供一種成本低、效果好的肝素親和柱。

本發明的另一個目的是提供上述肝素親和柱的制備方法。

本發明還有一個目的是提供上述肝素親和柱的應用。

本發明采用瓊脂糖凝膠6FF介質(國產)作為固相載體，經過環氧化與胺化后與肝素相偶聯制備親和層析柱，降低親和柱的制備成本，簡化制備方法，用普通試劑代替傳統制備過程使用的劇毒試劑，與此同時保證親和柱的穩定性與親和能力。

本發明的技術方案如下：

一種肝素親和柱，該肝素親和柱是通過下列方法制備得到的：瓊脂糖凝膠6FF作為固相載體，載體先進行活化，偶聯上環氧基團后，再進行胺化偶聯上胺基，胺化瓊脂糖凝膠6FF與肝素在甲醇中形成中間產物醛亞胺，再進一步還原胺化形成穩定化學鍵即得肝素瓊脂糖凝膠6FF。

所述的肝素親和柱，該肝素親和柱是通過下列方法制備得到的：

a.瓊脂糖凝膠6FF首先用環氧氯丙烷進行活化，即在水中分別以終濃度為20～30％(v/v)的瓊脂糖凝膠6FF、5～10％(v/v)的環氧氯丙烷、0.3～0.5mol/L的NaOH進行混合，37℃反應1-2h，得到環氧化瓊脂糖凝膠6FF；

b.取20g環氧化瓊脂糖凝膠6FF加1～2倍體積濃氨水(通常為25％-28％)37℃反應1-2h，獲得胺化瓊脂糖凝膠6FF；

c.胺化瓊脂糖凝膠6FF與肝素鈉混合物在甲醇中預處理：按1g胺化瓊脂糖凝膠6FF中加入30～50mg肝素鈉與1～2ml甲醇混合，在氮氣環境下室溫振搖36-52h，形成醛亞胺；

d.按1g胺化瓊脂糖凝膠6FF加20～30mg硼氫化鈉比例，將硼氫化鈉加入醛亞胺，對醛亞胺還原，得到肝素瓊脂糖凝膠6FF。

所述肝素親和柱的制備方法，該方法包括下列步驟：瓊脂糖凝膠6FF作為固相載體，載體先進行活化，偶聯上環氧基團后，再進行胺化偶聯上胺基，胺化瓊脂糖凝膠6FF與肝素在甲醇中形成中間產物醛亞胺，再進一步還原胺化形成穩定化學鍵即得肝素瓊脂糖凝膠6FF。

所述的肝素親和柱的制備方法，該方法為：

a.瓊脂糖凝膠6FF首先用環氧氯丙烷進行活化，即在水中分別以終濃度為20～30％(v/v)的瓊脂糖凝膠6FF、5～10％(v/v)的環氧氯丙烷、0.3～0.5mol/L的NaOH進行混合，37℃反應1-2h，得到環氧化瓊脂糖凝膠6FF；