[發明專利]微生物固體菌劑及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 200810018144.4
• 申請日: 2008-05-07
• 公開（公告）號: CN101407762A
• 公開（公告）日: 2009-04-15
• 發明（設計）人: 孫榮高
• 申請（專利權）人: 孫榮高
• 主分類號: C12N1/00
• 分類號: C12N1/00;C12N1/16;C12N1/14;A23K1/16;C12R1/645;C12R1/845
• 代理公司: 蘭州振華專利代理有限責任公司
• 代理人: 張 真

1.一種微生物固體菌劑的制備方法，微生物固體菌劑由F306酵母融合菌、G361白地霉菌(Geotrichum?Candidum?Link)、根霉菌(Rhizopus)和固體培養基組成，其三種菌株總量的重量百分比為F306酵母融合菌為55～65％、G361白地霉菌為30～35％、根霉菌5～10％，所述的F306酵母融合菌的保藏號為CGMCC?2461；所述的G361白地霉菌(Geotrichum?Candidum?Link)是中國科學院微生物菌種中心保存的安全菌種，編號為AS.2.361；其特征在于包括有如下步驟：

A.瓊脂斜面培養基的制備及菌種的培養：

a.瓊脂斜面培養基的制備：麥芽汁0.5-2％、葡萄糖0.5-2％、蛋白胨0.2-0.6％、瓊脂粉1-3％、無菌水80-120ml，加熱溶解后，用1％的氫氧化鈉調pH值至5.5-6.5，經110-114℃，30-35分鐘蒸汽滅菌，然后在無菌條件下分裝于15×1.5cm的干燥滅菌的試管擺成斜面待凝固后備用；

b.菌種的培養：分別取F306酵母融合菌、G361白地霉菌和根霉菌的母種瓊脂斜面菌，在無菌條件下，轉種于上述制備的瓊脂斜面培養基上，經28-32℃、24-48小時培養，即得瓊脂斜面菌種，為一級菌種；

B液體培養基的制備及液體菌種的培養：

a.液體培養基的制備：在1升新鮮豆腐廢水或粉絲廢水或玉米淀粉廢水或洋芋淀粉廢水中加入硫酸銨1-2g，磷酸0.5-1ml，用1％的石灰水調pH?5.5-6.5，分裝于500ml三角燒瓶中，分裝量為瓶子容量的1/4，然后經110-112℃，30-35分鐘高壓滅菌，冷卻后備用；

b.分別取F306酵母融合菌、G361白地霉菌和根霉菌的一級菌種，在無菌條件下，接種于液體培養液中，經28-32℃、24-48小時培養，其培養液為二級菌種；

c.分別取F306酵母融合菌、G361白地霉菌和根霉菌的二級菌種再擴大培養，上搖床振蕩培養，經振幅100～120r/min、溫度28～32℃、18～24小時培養，其菌液為三級菌種；

d.分別將重量百分比為F306酵母融合菌為55～65％、G361白地霉菌為30～35％、根霉菌5～10％三級菌種再擴大培養，三種菌在同一個發酵罐，經28-32℃、18-24小時的通氣攪拌發酵培養，其菌液為F306酵母融合菌、G361白地霉菌和根霉菌混合菌劑，或為四級菌種繼續逐級擴大培養，用此菌劑作為制備固體菌劑的菌種；

C.固體菌劑的培養：

將含水比為60-80％新鮮的豆腐渣或粉絲渣或玉米淀粉渣或洋芋淀粉，加入經0.5-1.2％H₂SO₄處理的玉米芯粉和麩皮、玉米面，其中玉米芯粉、麩皮、玉米面的重量比為2～4∶1～3∶0.5～1，并加入相對于干料的0.2-4％的硫酸銨，相對于干料的0.1-3％的尿素，均勻攪拌，使其含水量達到45-65％，用1％的石灰水調節PH至5.5～6.5，然后加入相對于干料總量為8-12％F306酵母融合菌、G361白地霉菌和根霉菌混合菌液，充分攪拌混合均勻后，在發酵和干燥兩用發酵池中經溫度28～32℃通風攪拌發酵18～24小時后，再經40～60℃通熱風干燥，制成F306酵母融合菌、G361白地霉菌和根霉菌固體菌劑。

2.如權利要求1微生物固體菌劑的制備方法，其特征在于所述的F306酵母融合菌的制備有如下步驟：將酒精酵母菌(Saecharomycescervsiar)作母種的斜面轉種和培養，在液體振蕩培養14小時后，用EDTA-巰基乙醇進行預處理，使用1％的纖維素酶和1％蝸牛酶進行酶解脫壁，時間為2小時，溫度33℃，得到酒精酵母原生質體；將熱帶假絲酵母菌(Canadida?tropicalis)作母種的斜面轉種和培養，在液體振蕩培養14小時后，用EDTA-巰基乙醇進行預處理，使用1.5％的纖維素酶和0.5％的蝸牛酶進行酶解脫壁，時間為2.5小時，溫度33℃，得到熱帶假絲酵母原生質體；將熱帶假絲酵母原生質體經0.1％碘乙酸滅活，與酒精酵母原生質體以1∶1混合，將沉淀懸于35％聚乙二醇的促溶劑中，30℃水浴靜止處理，pH?6.0，時間為40min，融合菌液經高滲磷酸緩沖液反復沖洗，涂布于高滲選擇型培養基和高滲完全培養基平板培養基上，經30℃、7天培養，平板生長出F306酵母融合菌。