[發明專利]一種由雷公藤懸浮細胞誘導不定根的方法

有效

• 申請號: 200810017697.8
• 申請日: 2008-03-13
• 公開（公告）號: CN101248757A
• 公開（公告）日: 2008-08-27
• 發明（設計）人: 張興;李琰;馮俊濤;王智輝;王永宏
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學無公害農藥研究服務中心
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;C12N5/04
• 代理公司: 西安弘理專利事務所
• 代理人: 羅笛

技術領域

本發明涉及一種雷公藤不定根培養方法，特別是一種由雷公藤懸浮細胞誘導不定根的方法，該方法生產的雷公藤不定根中所含的雷公藤甲素和總生物堿相對較高，具有生產周期短、效率高、對環境無污染等特點，并且有利于雷公藤自然資源的保護。

背景技術

雷公藤(Tripterygium?wilfordii?Hook.f.)系衛矛科雷公藤屬植物，在我國很早以前就用于醫學和防治各種害蟲，為著名的殺蟲植物之一。民間多用于防治蔬菜害蟲，故有“菜藥”之稱。其對多種害蟲有效。傳統中醫上可用于治療腫脹、水腫、黃白疽、痢疾等，具有明顯的抗腫瘤、抗風濕作用。雷公藤屬多年生木質藤本、生長緩慢、處于野生狀態，因用根入藥，大量應用使資源遭到破壞。

雷公藤根中的活性成分含量顯著高于其他部位，是主要藥用部位?，F已從中分離出70多種化學成分，其中雷公藤甲素又稱雷公藤內酯醇，是中藥雷公藤的主要有效成分之一，作為免疫抑制藥物，可應用于許多自身免疫性疾病的治療，同時它又是一種毒性成分。雷公藤生物堿具有明顯的體液和細胞免疫抑制作用，也是治療類風濕性關節炎的有效成分。在農業害蟲防治中，雷公藤甲素有較好的觸殺活性，雷公藤總生物堿有較好的胃毒毒殺活性和拒食活性。這些有效成分均為次生代謝產物，在雷公藤植株內含量很低，在其他植物內的含量更低，雖然可通過化學分離提取獲得產品，但受氣候、土壤、分布等因素及有效成分含量、原料、季節等條件的限制，生產受到一定的限制，加上人類對自然的過度開發，資源受到破壞，提取量很有限。

雷公藤細胞培養生產有效成分在國內外已進行了大量研究。在國內，尹作鴻等人從雷公藤的莖、葉誘導出愈傷組織，并進行了組織培養，從中分離得到雷公藤甲素、雷公藤乙素等二萜內酯化合物。曹華興等(2002年)申請發明專利提出采用懸浮法培養雷公藤植物細胞而生產雷公藤總生物堿的方法，該方法得到的產物所含雷公藤總生物堿的含量為植物體的2.9倍。在國外，早在1980年美國喬治頓大學生物學Dujack?L?W等采用細胞懸浮培養法，并報告了組織培養中前體的影響。與此同時，加拿大學者J.P?Kutney等也用雷公藤莖葉進行組織培養成功，把雷公藤內酯醇和雷公藤內酯二醇的產最較根中含量分別提高了3倍和16倍，并探索以托品類(Terpenoids)作為前體物促進雷公藤內酯二醇的生物合成。M?Mjsawa等(1982年)報告了用含蔗糖和植物激素的瓊脂對雷公藤進行組織培養結果，經培養后的細胞所含雷公藤內酯二醇比原植物含量高10倍。日木Kyowa?Hakko?kogyo公司也為組織培養生產雷公藤內酯醇和雷公藤內酯二醇申請專利。這些對雷公藤細胞培養的研究從不同方面進行了有益的探索，但遠未達到工業化生產的水平。而關于雷公藤不定根懸浮培養法生產雷公藤甲素和總生物堿的方法尚未見到報道。

一般來說，植物的次生代謝產物在已經分化的組織中含量較高，且器官培養相對比較穩定，因此采用苗或根培養的方法是生產次生代謝產物的另一條途徑。根培養對植物有著特殊的意義，因為許多植物次生代謝物均來自于根部。但工業化培養生產根類的實例并不多，韓國目前在高麗參根類培養方面已經取得了突破性進展，采用了5～10t的反應器，并以培養的根為原料開發了系列產品。用有一定的器官分化的不定根作為懸浮培養的材料，生產其代謝產物，要比細胞培養有效成分要高得多，但不定根的誘導需要克服更多技術上的困難，并非所有植物均可進行不定根誘導。

植物細胞全能性的設想于1902年提出，1948年得到了證實，這為進行植物組織培養工作奠定了理論基礎，自從1956年Routine和Nickel首次申請用植物組織培養生產有用次生代謝產物的專利以來，應用細胞培養生產有用的次生物質的研究取得了很大的進展。大量研究成果證明，通過植物細胞發酵培養產生有用的次生代謝產物越來越顯示出巨大的應用潛力。利用植物細胞培養生產次生代謝產物不受地理、季節變換和各種環境因素的影響；可節省土地，降低成本，縮短生產周期；可以提供一種標準化的生產過程，該過程可以連續生產，產品的質量和產量穩定，便于實行工業化生產，已是解決各種有效成分含量低的植物資源利用的主要途徑。這是本申請的試驗基礎和理論基礎。

發明內容

為了保護雷公藤的自然資源，本發明的目的在于提供由雷公藤懸浮細胞誘導不定根的方法。

為了實現上述任務，本發明采取如下的技術解決方案：

一種由雷公藤懸浮細胞誘導不定根的方法，其特征在于，具體包括下列步驟：