[發明專利]表達嗜熱毛殼菌基因cbh3的畢赤酵母工程菌株

無效

• 申請號: 200810016736.2
• 申請日: 2008-06-05
• 公開（公告）號: CN101307295A
• 公開（公告）日: 2008-11-19
• 發明（設計）人: 李多川;趙春青;李亞玲;李安娜;李華
• 申請（專利權）人: 山東農業大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/56;C12N15/81;C12P19/14;C12R1/84
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(一)技術領域：

本發明涉及生物工程，具體地說是一種表達嗜熱毛殼菌(Chaetomiumthermophilum)熱穩定外切-β-1，4-葡聚糖酶基因cbh3的畢赤酵母工程菌株Pichia?pastoris?GS-CBH3-27。

(二)背景技術：

纖維素在自然界儲量極其豐富，是第一大可再生資源。纖維素的生物降解是通過纖維素酶實現的。纖維素酶是一個復合酶系，包括內切-β-1，4-葡聚糖酶(EC?3.2.1.4)(EG)、β-1，4-纖維二糖水解酶(EC?3.2.1.91)(CBH)及β-1，4-葡萄糖苷酶(EC?3.2.1.21)(BG)。這三種酶協同作用，徹底切割β-1，4-糖苷鍵，使纖維素最終降解為葡萄糖。其中內切-β-1，4-葡聚糖酶是纖維素酶系最主要的成分，它首先作用纖維素，水解纖維素鏈非結晶區的β-1，4-糖苷鍵將纖維素鏈打開，它對整個纖維素的降解起重要的作用。

纖維素酶廣泛應用于輕工、醫藥、環保、食品加工、飲料工業、紡織工業、可再生資源的綜合利用等方面，被認為是最有應用潛力的酶制劑之一。目前國內外纖維素酶主要由嗜溫真菌曲霉和木霉生產，但存在菌種產酶量低、活力低、酶穩定性差及成本高等問題，使其纖維素酶的生產和應用受到很大限制。由于熱穩定纖維素酶在高溫條件下的熱穩定，因此具重要應用前景和商業價值。

嗜熱毛殼菌(Chaetomium?thermophilum)是一種廣泛分布于土壤中的嗜熱真菌。該菌在微晶纖維素為唯一碳源的培養基中50℃條件下可以產生熱穩定的纖維素酶，但要使之用于規?；I生產，還存在一些尚未解決的問題。如嗜熱毛殼菌培養條件比較苛刻，高溫發酵需要特殊設備，產酶效率低，造成成本增加，因此限制了它的應用。解決這一問題的有效途徑是應用分子生物學手段，將嗜熱毛殼菌熱穩定纖維素酶基因導入酵母中高效表達，利用酵母生長快、易于培養等特點，使熱穩定纖維素酶基因在常溫和短時間內快速、大量表達，期望達到降低能耗和提高經濟效益的目的。

(三)發明內容：

本發明的目的是從嗜熱毛殼菌(Chaetomium?thermophilum)獲得外切-β-1，4-葡聚糖酶基因cbh3的全長cDNA，命名為cbh3(DQ085790)，嗜熱毛殼菌cbh3全長的cDNA為1607bp，包括起始密碼子和多聚A尾。開放閱讀框(ORF)部分為1356bp，編碼451個氨基酸的一段序列，將此氨基酸序列在國際基因庫中進行檢索，發現屬于第7家族糖苷酶，其中6個基序DANWRW、FDVDVS、DLWEEV、GYCDSAQC、MVLVMS和MLWLDS具保守性。

利用獲得的嗜熱毛殼菌cbh3基因，構建重組表達質粒載體pPIC9K/cbh3，利用電轉儀進行電擊轉化Pichia?pastoris?GS115，在MD和MM培養基上篩選，經PCR鑒定篩選陽性轉化子，G418篩選多拷貝轉化子，然后進行甲醇誘導表達，獲得表達外切-β-1，4-葡聚糖酶基因cbh3的畢赤酵母工程菌株GS-CBH3-27。該工程菌株接種于含BMGY培養基中，在30℃250rpm/min搖床培養6d后，外切-β-1，4-葡聚糖酶表達量為1.7mg/mL，分子量為48kDa，酶在60℃保溫60min，仍有97％的活性，在70℃保溫60min，仍有60％的活性，80℃的半衰期為10min。

該工程菌株GS-CBH3-27能夠高效表達(1.7mg/mL)嗜熱毛殼菌外切-β-1，4-葡聚糖酶基因cbh3，分泌的外切-β-1，4-葡聚糖酶具較高的熱穩定性，能用于植物纖維素的生物降解，有重要的經濟價值和社會價值。

(四)附圖說明：

圖1表達嗜熱毛殼菌基因cbh3的畢赤酵母工程菌程序圖

圖中：是嗜熱毛殼菌的分離鑒定

是嗜熱毛殼菌外切-1，4-β-葡聚糖酶基因cbh3的克隆

是基因cbh3表達載體的構建

是表達基因cbh3的酵母工程菌株的構建及篩選

是畢赤酵母Pichia?pastoris?GS115的誘導表達和活性檢測

是表達嗜熱毛殼菌基因cbh3畢赤酵母工程菌株GS-CBH3-27的保藏

圖2外切-1，4-β-葡聚糖酶基因cbh3PCR產物電泳圖譜

泳道1：Marker-DL2000

泳道2：cDNA(ORF)(分子量1356bp)

圖3外切-1，4-β-葡聚糖酶CBH3的SDS-PAGE分析

泳道1和8：低分子量蛋白標準