[發明專利]遲緩愛德華氏菌疫苗抗原及其制備方法

無效

• 申請號: 200810016124.3
• 申請日: 2008-05-09
• 公開（公告）號: CN101319009A
• 公開（公告）日: 2008-12-10
• 發明（設計）人: 孫黎;侯進慧
• 申請（專利權）人: 中國科學院海洋研究所
• 主分類號: C07K14/195
• 分類號: C07K14/195;C12N15/31;C12N15/70;A61K39/02;A61P31/04
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司
• 代理人: 許宗富;周秀梅

技術領域

本發明涉及分子免疫學領域，具體的說是遲緩愛德華氏菌疫苗抗原及其制備方法。

背景技術

遲緩愛德華氏菌為革蘭氏陰性桿菌，具有廣泛的宿主范圍，包括人類及各種水、陸生動物。在水產養殖動物中，該菌能夠感染多種重要淡、海水魚類，如鯉魚、羅非魚、牙鲆、鰻魚、鰭魚等。由于遲緩愛德華氏菌能夠在所感染的水生動物中誘發一種嚴重的系統性疾病-愛德華氏菌病(Edwardsiellosis)，因而對水產養殖業造成巨大的經濟損失。

目前對于愛德華氏菌病的防治主要依賴于抗生素(包括各種化學藥物)和疫苗免疫兩條途徑。由于抗生素對動物、人類以及環境所造成的長期性危害，其應用已逐漸在國際上受到限制。疫苗免疫雖然已證明為最為有效的病害防治措施，但就遲緩愛德華氏菌而言，由于其免疫相關基礎研究仍在起始階段，目前世界上應用于水產業的愛德華氏菌疫苗主要為簡單的滅活全菌疫苗，尚未有高效的分子疫苗如重組亞單位疫苗等。滅活疫苗雖然安全但往往由于抗原成分和結構在制備過程中被部分破壞而達不到理想的免疫效果。相對而言分子疫苗(重組亞單位疫苗、DNA疫苗等)則具有特異性強、免疫效應較高等特點。因而篩選和獲得具免疫保護效應的分子疫苗抗原是愛德華氏菌病免疫防治的關鍵之一。

發明內容

本發明目的在于提供兩種遲緩愛德華氏菌疫苗抗原及其制備方法。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：

遲緩愛德華氏菌疫苗抗原：具有序列表SEQ?ID?No.1。

制備方法：

1)質粒pET258構建：將經BglII/NdeI雙酶切的質粒pET25回收的104bp片段與經BglII/NdeI雙酶切的質粒pET28回收的5.3kb片段用T4DNA連接酶連接2-4小時，連接液轉化入大腸桿菌中并在含卡那霉素的LB培養基上培養18-24小時，篩選轉化子提取質粒，即為pET258；

2)質粒構建：以菌株TX1為模板，采用EDF1和EDR1為引物進行PCR擴增，純化產物后與載體pBS-T載體于室溫連接2-4小時，連接混合液轉化大腸桿菌后在含卡那霉素、Xgal、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB培養基上培養18-24小時，篩選出白色轉化子為質粒pBSED；而后將質粒pBSED用NdeI/XhoI雙酶切回收0.58kb，同時將步驟1)的質粒pET258用NdeI/XhoI雙酶切回收5.3kb片段；將質粒pBSED用NdeI/XhoI雙酶切回收0.58kb與質粒pET258用NdeI/XhoI雙酶切回收5.3kb片段用T4DNA連接酶于室溫連接2-4小時，連接液轉化入大腸桿菌DH5α后在含有Kn(50ug/ml)的LB固體培養基上培養18-24小時，挑取2個轉化子提取質粒為質粒pETED；

其中所述菌株TX1保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，地址為北京市朝陽區大屯路，保藏編號為：CGMCC?No.2330，分類命名為遲緩愛德華氏菌Edwardsiella?tarda；保藏日期：2008年1月9日；

所述引物EDF1??5’-CATATGACGACTATCGACAGCG-3’和EDR1(5’-CTCGAGGGACATGCGTACGCTGC-3’；

3)質粒的誘導表達：將步驟2)的質粒pETED轉化入大腸桿菌中，在含有Kn的LB培養基上培養18-24小時，篩選轉化子即為BL21/pETED；將BL21/pETED于含有Kn的LB培養基中過夜培養；而后再將培養液加入到新鮮的含有Kn的LB液體培養基中，于37℃搖動培養至OD₆₀₀為0.6，加入終濃度為1mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，37℃繼續搖動培養4-5小時，裂解菌體，離心收集上清，純化重組蛋白，即為具有序列表SEQ?ID?No?1的堿基序列的重組保護性疫苗抗原EseD；

其中：培養液與新鮮的含有Kn的LB液體培養基體積比為1∶100；BL21/pETED與含有Kn的LB培養基體積比1∶100。

遲緩愛德華氏菌疫苗抗原：具有序列表No.2中的堿基序列。

制備方法：

1)質粒pET258構建：將經BglII/NdeI雙酶切的質粒pET25回收的104bp片段與經BglII/NdeI雙酶切的質粒pET28回收的5.3kb片段用T4DNA連接酶連接2-4小時，連接液轉化入大腸桿菌中并在含卡那霉素的LB培養基上培養18-24小時，篩選轉化子提取質粒，即為pET258；