[發(fā)明專利]半滑舌鰨雌性特異分子標記及其應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810015987.9
• 申請日: 2008-05-09
• 公開（公告）號: CN101270389A
• 公開（公告）日: 2008-09-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳松林;馬洪雨;李靜;鄧思平;田永勝;沙珍霞
• 申請（專利權(quán)）人: 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/10;C12N15/12
• 代理公司: 青島發(fā)思特專利商標代理有限公司
• 代理人: 蔡紹強

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于水產(chǎn)生物技術(shù)領(lǐng)域中的魚類分子標記和遺傳性別鑒定技術(shù)，是一種能在魚類單性育種中應(yīng)用的魚類遺傳性別鑒定的分子生物學方法。

背景技術(shù)

我國有著豐富的魚類資源，其中許多魚類在生長速率上存在著性別差異，例如，羅非魚雄性比雌性生長快約40％以上，而牙鲆和半滑舌鰨等海水魚類，雌性個體比雄性個體生長快40％-100％，因此，開展這些魚類遺傳性別檢測和性別控制的研究既有重要的科學意義，又有重大的應(yīng)用潛力和推廣前景。

半滑舌鰨(Cynoglossus?semiliaevis)是我國特有的一種名貴經(jīng)濟海水魚類，屬于近海溫水性底層魚類，我國沿海均有分布，以黃海、渤海為多。半滑舌鰨由于其味道鮮美，肉質(zhì)細嫩，營養(yǎng)豐富，深受廣大消費者歡迎，其市場價值極高，養(yǎng)殖前景非常廣闊。盡管近2年來，半滑舌鰨人工育苗技術(shù)獲得突破，年產(chǎn)半滑舌鰨苗種近百萬尾，不過，研究表明半滑舌鰨雌性個體和雄性個體在生長速率上存在巨大差別，其雌性個體比雄性個體大2-3倍(黃海水產(chǎn)研究所，孟田湘等，1988)。由于雄性個體生長過慢，降低了半滑舌鰨的養(yǎng)殖產(chǎn)量，增加了養(yǎng)殖成本，因而嚴重影響了半滑舌鰨苗種的推廣及養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的形成，由于難以鑒定半滑舌鰨的遺傳性別，嚴重影響了半滑舌鰨雌核發(fā)育和性別控制研究的進行。

有關(guān)魚類性別相關(guān)分子標記的研究，目前只是在少數(shù)幾種魚類上進行過。采用的主要方法包括RAPD、SSR和AFLP等。加拿大西溫哥華實驗室的Devlin(1994)找到了大鱗大馬哈魚Y染色體特異的DNA片段；匈牙利農(nóng)業(yè)生物技術(shù)中心的Kovacs等(2000)用RAPD掃描非洲鯰魚雌雄基因池，找到兩個雄性性別相關(guān)的RAPD標記，一個(CgaY1)大約2.6kb，另一個(CgaY2)458bp，這是首次從鯰魚中找到性別特異的DNA標記。美國新罕布什爾大學的Lee等(2004)用分離集團分析法尋找羅非魚表型性別相連鎖的DNA標記，找到10個與羅非魚表型性別連鎖的微衛(wèi)星標記。這些標記可以直接用于不同Y染色體等位基因功能的研究和具有一個或者幾個Y染色體拷貝的親魚的鑒定。英國Stirling大學的Ezaz等(2004)用AFLP技術(shù)掃描尼羅羅非魚基因組，找到三個Y染色體連鎖(OniY425、OniY38?2、OniY227)和一個X染色體連鎖(OniX420)的AFLP標記。目前的研究還只是在某些魚類找到少數(shù)雄性性別相關(guān)的分子標記，但還沒有找到魚類雌性性別特異的分子標記。而有關(guān)半滑舌鰨性別特異分子標記以及遺傳性別鑒定的分子生物學技術(shù)，目前國內(nèi)外均未見報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的，是為了篩選出半滑舌鰨雌性特異分子標記，獲得性別特異分子標記的序列，并在半滑舌鰨遺傳性別鑒定中進行應(yīng)用，為半滑舌鰨性別控制和全雌育種研究提供分子標記和技術(shù)方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

研究一種半滑舌鰨雌性特異分子標記的篩選方法，包括半滑舌鰨基因組DNA的提取，基因組DNA的AFLP分析，雌性特異分子標記的篩選，其特征是：

一、半滑舌鰨雌性特異分子標記的篩選，包括：

1、半滑舌鰨基因組DNA的提?。?/p>

2、基因組DNA的AFLP分析；

3、雌性特異分子標記的篩選；

二、半滑舌鰨雌性特異分子標記的克隆與序列，包括：

1、半滑舌鰨雌性特異分子標記的回收；

2、雌性特異分子標記的克?。?/p>

3、雌性特異分子標記的序列；

三、半滑舌鰨雌性特異分子標記的應(yīng)用；包括：

該標記應(yīng)用于無損傷鑒別半滑舌鰨的遺傳性別，具體方法是：

采集待測半滑舌鰨魚基因組DNA，根據(jù)獲得的3個半滑舌鰨雌性特異分子標記的序列，分別設(shè)計3對特異引物，其引物序列分別為：

CseF136N1(5’-AAGTAACGACACGAAGGG-3’)和

CseF136C1(5’-AACCGAGTGAAATGTGATAG-3’)；

CseF464N1(5’-CACAGCCAGGATGAGGAT-3’)和

CseF464C1(5’-TCAGTTGGAAAACGGAGAA-3’)；

CseF783N1(5’-AGATTCAAGCATGACGGT-3’)和

CseF783C1(5’-GATTTTGGACAGAGGAGC-3’)；

采用其中任意1對雌性特異引物進行PCR擴增，就可以對半滑舌鰨魚進行遺傳性別鑒定；