[發明專利]生產偶數200bp梯度DNA分子量標準的超級質粒及制備方法

無效

• 申請號: 200810015779.9
• 申請日: 2008-05-07
• 公開（公告）號: CN101575601A
• 公開（公告）日: 2009-11-11
• 發明（設計）人: 葉春江
• 申請（專利權）人: 濟南大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12P19/34
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.生產偶數200bp梯度DNA分子量標準的超級質粒，該質粒是一種全新的超級DNA分子量標準質粒，其特征在于：其中含有400bp、600bp、800bp、1000bp、1400bp、2000bp、3000bp七條片段；400bp為雙拷貝；經EcoR?I酶切后可以獲得一個由7條片段組成的200bp偶數DNA分子量標準梯度；同時各條DNA帶的濃度(質量)之間具有一定的比列關系(4∶3∶4∶5∶7∶10∶15)。

2.根據權利要求1所述的生產偶數200bp梯度DNA分子量標準的超級質粒的制備方法，包括通過PCR的方法分別擴增400bp、600bp、800bp、1000bp、1400bp、2000bp幾條片段，其特征在于：

(1)對400bp、600bp、800bp分別通過普通Taq?DNA聚合酶進行擴增；

(2)對1400bp、1000bp分別通過pfu?DNA聚合酶進行擴增；

(3)利用Taq?DNA聚合酶的加尾活性對1400bp和1000bp兩條片段加T；

(4)利用A/T互補在離心管中建立連接體系，使600bp、800bp、1000bp連接成600-800-1000的單元，400bp和1400bp連接成400-1400-400的單元；

(5)通過T/A克隆試劑盒，把上述的600-800-1000、400-1400-400兩個單元分別克隆到T載體中形成中間載體T681和T4144；

(6)通過Pst?I酶切將400-1400-400單元從T4144中切出來，并回收；同時T681載體也被Pst?I完全酶切，并利用CIAP進行載體脫磷處理；

(7)把400-1400-400單元連接進上述的脫磷處理的T681載體獲得中間載體T6814144；

(8)將2000bp片段克隆到T載體中，然后用內切酶Sph?I再切出來，連入同樣Sph?I酶切和CIAP脫磷處理的T6814144，獲得超級質粒pYE9600。

3.根據權利要求2所述的生產偶數200bp梯度DNA分子量標準的超級質粒制備方法，其特征在于：所述的400bp、600bp、800bp分別通過聚合酶進行擴增，具體是指用Taq?DNA聚合酶進行擴增。

4.根據權利要求2所述的生產偶數200bp梯度DNA分子量標準的超級質粒制備方法，其特征在于：所述的1400bp、1000bp分別通過聚合酶進行擴增，具體是指用pfu?DNA聚合酶進行擴增。