[發明專利]一種偶數200bp梯度DNA分子量標準及其快速制備方法

無效

• 申請號: 200810015777.X
• 申請日: 2008-05-07
• 公開（公告）號: CN101575599A
• 公開（公告）日: 2009-11-11
• 發明（設計）人: 葉春江
• 申請（專利權）人: 濟南大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12P19/34
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種偶數200bp梯度DNA分子量標準，其特征是由7條DNA帶組成的限制性內切酶酶切混合物，長度分別為：400bp、600bp、800bp、1000bp、1400bp、2000bp、3000bp；各條DNA帶的濃度(質量)之間具有一定的比列關系(2∶3∶4∶5∶7∶10∶15)。

2.根據權利要求1所述的一種偶數200bp梯度DNA分子量標準的快速制備方法，7條DNA帶是以質粒pYE9600酶切對象，通過大腸桿菌發酵和堿裂解法提取目標質粒pYE9600，經過純化，用限制性內切酶EcoR?I進行酶切消化，從而釋放其中所含的200bp系列片段，其特征在于：

①取-20℃冷凍保存的pYE9600質粒2-5微升通過熱激轉化的方法將其轉入大腸桿菌DH5α或JM109中，涂布于含有氨芐青霉素的平板上，倒置于37℃恒溫箱內過夜培養，第二天挑單菌落，用含有氨芐青霉素的LB液體培養基(5ml)培養至OD600＝0.8，轉接于100ml含有氨芐青霉素的LB液體培養基中，搖床劇烈震蕩培養3-5小時，至OD600＝0.6時，繼續以1∶100的比例轉接于已37℃預熱的含有氨芐青霉素的LB液體培養基(1000ml)中培養12-16小時；

②目標質粒pYE9600的大量制備及純化，其過程包括以下步驟：

(1)于250ml離心瓶中4100-6000rpm常溫或4℃收菌，離心時間為3-10分鐘，獲得菌體沉淀；用20ml的溶液I重懸菌體沉淀；并將之轉入600ml的礦泉水瓶中；

(2)分別加入40ml新配制的溶液II，擰好蓋子，輕輕顛倒數次，使內容物徹底混勻，室溫下放置10-15分鐘；

(3)分別加入30ml冰預冷的溶液III，擰好蓋子，輕輕地但完全地顛倒、震蕩混勻幾次(此時不應再有分離的兩個液相)；將礦泉水瓶在冰上放10-20分鐘；

(4)將礦泉水瓶中的內容物轉入離心瓶中，平衡后離心；

(5)6000rpm離心20分鐘，將上清輕輕轉入量筒中，棄去離心瓶中的沉淀；

(6)加30ml氯仿抽提；

(7)轉入分液漏斗，靜置5分鐘，待分相后，分別收集下層的有機相(氯仿)和上層的水相；

(8)將水相10,000rpm離心10分鐘；

(9)合并所有水相(加入10ul的RNase，室溫靜置10分鐘)，量其體積，加入0.7倍體積的異丙醇，并充分混勻，室溫下放置10-20分鐘；

(10)室溫下8000rpm離心15分鐘，以回收核酸沉淀；

(11)小心棄去上清，將離心管敞開蓋，倒置于紙巾上以除去殘余的上清；

(12)室溫下用5ml?70％的乙醇刷洗管底及管壁，小心的倒掉乙醇(注意防止沉淀物的倒出)，并將離心管開口倒置于紙巾上使剩余的乙醇揮發掉(15-20分鐘)；

(13)5ml?TE(pH8.0)溶解濕潤的核酸沉淀；

(14)溶解后得到的質粒溶液用等體積的酚-氯仿抽提3遍，以充分去除蛋白質，獲得澄清的液體；

③利用所獲得的pYE9600質粒建立酶切反應體系，其中反應緩沖液的體積為反應總體積的1/10；加入適量的內切酶，充分混勻后于37℃水浴保溫20-50個小時；之后將瓊脂糖凝膠放入電泳槽中，加入電泳緩沖液(TAE)，使凝膠浸于液面下約3mm，將部分酶解產物取出并進行梯度稀釋，加入適量的凝膠上樣緩沖液(loading?buffer)并混合，用移液槍將之加入凝膠孔中，以5V/cm的電壓進行電泳，使核酸分子向陰極泳動，當溴酚蘭泳動到凝膠的三分之二處時停止電泳，在紫外透射儀上觀察酶切產物的純度及產量；

④所得的偶數200bp梯度DNA分子量標準的純化：用酚∶氯仿為1∶1的混合溶劑抽提，去除其中的蛋白質(主要是內切酶)成份，一般經過2-3次的抽提即可達到滿意的效果；通過向體系中加入適量的TE緩沖液，將3000bp的DNA條帶定量為150ng，其他條帶的量依次為(從大到小)100ng、70ng、50ng、40ng、30ng、20ng。