[發(fā)明專利]一種細胞壁破壁釋放胞內藻毒素的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810015351.4
• 申請日: 2008-04-22
• 公開（公告）號: CN101260142A
• 公開（公告）日: 2008-09-10
• 發(fā)明（設計）人: 賈瑞寶;孫韶華;陳家全;周維芳
• 申請（專利權）人: 濟南市供排水監(jiān)測中心
• 主分類號: C07K1/14
• 分類號: C07K1/14
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所
• 代理人: 李桂存

(一)技術領域

本發(fā)明涉及一種用于藻類的胞內藻毒素釋放方法，特別是一種細胞壁破壁釋放胞內藻毒素的方法。

(二)背景技術

世界各地25％-70％的藍藻水華可產(chǎn)生毒素，在有毒性的7個屬的藍藻中，主要產(chǎn)毒的是魚腥藻(Anabaena?Bory)、束絲藻(Aphanizomenon?Morr.)和微囊藻(Microcystis?Kütz)屬中的某些品系，其中微囊藻毒素是一類分布最廣泛且與人類關系最為密切的七肽單環(huán)肝毒素，是強烈的肝臟腫瘤促進劑。微囊藻毒素通常大部分存在于藻細胞內，當細胞破裂或衰老時毒素釋放進入水中。

藻毒素分為胞內藻毒素(IMC)和胞外藻毒素(EMC)。IMC存在于藻細胞內，當細胞破裂或衰老時，藻毒素會釋放進入水體。

胞內藻毒素存在于藻細胞內部，需要采取必要的細胞壁破壞方式確保IMC釋放出來。破壞細胞壁的方法有很多，其中超聲破碎法是一種最常用的方法，超聲破碎法的操作步驟：水樣經(jīng)20MHz的超聲波間歇振蕩2h，破碎藻細胞；用0.45μm濾膜將藻渣濾去，釋放出來的胞內藻毒素在濾液中。但最近研究表明，雖然超聲波能夠通過使細胞壁破裂而促進胞內藻毒素的釋放，但同時也會引起藻毒素多肽結構的斷裂而損失部分毒素，并最終導致測定結果偏低。

(三)發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是：提供一種細胞壁破壁釋放胞內藻毒素的方法，使其不破壞藻毒素。

為了解決上述技術問題，本發(fā)明包括如下依次進行的步驟：(1)凍融藻體使細胞壁破裂；(2)酸解藻體；(3)萃取，使藻渣和胞內藻毒素分離，取上清液。

為了便于本方法的實施，所述步驟(1)采用液氮凍融；步驟(2)采用乙酸酸解。

為了使胞內藻毒素充分釋放，當取10L水所含的藻體量時：所述步驟(1)中凍融時間是1-2min；步驟(2)中酸的濃度為5％，用量為10mL；步驟(3)中萃取方法為3500-4000r/min下離心萃取8-10分鐘，重復萃取3次，合并上清液。

本發(fā)明的有益效果是：采用本方法釋放胞內藻毒素的過程中，不會引起藻毒素多肽結構的斷裂，使胞內藻毒素完好、充分的釋放出來，減小藻毒素的測定誤差，提高水質檢測的準確性。本發(fā)明特別適于受藍藻污染水源水中藻毒素的測試。

(四)具體實施方式

具體實施實例一

將10L含藻水通過濾膜過濾，過濾后的藻類用紗布包好，置入液氮罐中保持1min，然后放入離心試管，加以5％乙酸10mL，在3600r/min下離心萃取9分鐘，重復萃取3次，合并上清液。

具體實施實例二

將10L含藻水通過濾膜過濾，過濾后的藻類用紗布包好，置入液氮罐中保持1.6min，然后放入離心試管，加以5％乙酸10mL，在3950r/min下離心萃取8.5分鐘，重復萃取3次，合并上清液。

具體實施實例三

將10L含藻水通過濾膜過濾，過濾后的藻類用紗布包好，置入低溫環(huán)境中保持1.9min，然后放入離心試管，加以適量硫酸，在4000r/min下離心萃取10分鐘，重復萃取3次，合并上清液。

將發(fā)明方法和超聲破碎法獲得的粗提液進行含量測定，每種方法的三個平行樣的檢測結果見表1。

表1凍融酸解法和超聲破碎法對含藻水藻毒素提取量比較

從表1中可以看出，本發(fā)明方法的粗提效率和粗提精密度均比超聲破碎法要好。