[發明專利]一種交叉保護性疫苗抗原及其制備方法和應用

無效

• 申請號: 200810014711.9
• 申請日: 2008-02-29
• 公開（公告）號: CN101519440A
• 公開（公告）日: 2009-09-02
• 發明（設計）人: 孫黎;張衛衛;程爽
• 申請（專利權）人: 中國科學院海洋研究所
• 主分類號: C07K14/28
• 分類號: C07K14/28;C12N15/31;C12N15/70;A61K39/106;A61K35/74;A61P31/04
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司
• 代理人: 許宗富;周秀梅

1.一種交叉保護性疫苗抗原，其特征在于：交叉保護性疫苗抗原由序列表SEQ?ID?No.2中的氨基酸序列所示。

2.一種按權利要求1所述的交叉保護性疫苗抗原制備方法，其特征在于：

1)質粒pET258構建：將經BglII/NdeI雙酶切的質粒pET25回收的104bp片段與經BglII/NdeI雙酶切的質粒pET28回收的5.3kb片段用T4DNA連接酶連接，連接液轉化入大腸桿菌中并在含氨芐青霉素的LB培養基上培養18-24小時，篩選轉化子提取質粒，即為pET258；

2)質粒pEVQ構建：

a.以哈氏弧菌T4為模板，用引物VHQF5?5’-CATATGGCGCTTCCACTCAGTGTGG-3’，VHQR5?5’-CTCGAGGCGGATAACGAGGTAAACC-3’，進行PCR擴增，產物純化后與載體pBS-T于室溫連接2-8小時，連接混合液轉化大腸桿菌后在含氨芐青霉素、Xgal、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB培養基上培養18-24小時，篩選轉化子提取質粒，即為質粒pBTQ；

其中所述哈氏弧菌T4保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏編號為：CGMCC?No.1985；

b.將步驟a的質粒pBTQ用限制性內切酶NdeI/XhoI雙酶切后電泳，回收1.3kb?DNA片段，將其與步驟1)的質粒pET258連接，轉化入大腸桿菌，在含有Kn的LB培養基上培養18-24小時，篩選轉化子提取質粒，即為質粒pEVQ；

3)質粒pEVQ的誘導表達：將步驟2)的質粒pEVQ轉化入大腸桿菌中，在含有Kn的LB培養基上培養18-24小時，篩選轉化子即為BL21/pETQ，將BL21/pETQ于含有Kn的LB培養基中過夜培養；而后再將培養液加入到新鮮的含有Kn的LB液體培養基中，于37℃搖動培養至OD600為0.6，加入終濃度為1mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，37℃繼續搖動培養4-5小時，裂解菌體，離心收集上清，純化重組蛋白，即為由序列表SEQ?ID?No.2中的氨基酸序列組成的重組交叉保護性疫苗抗原VhdQ。

3.按權利要求2所述的交叉保護性疫苗抗原制備方法，其特征在于：所述步驟2)中PCR條件為：94℃60s預變性模板DNA，然后94℃40s，58℃60s，72℃60s，5個循環后改為94℃40s，65℃60s，72℃60s，25個循環后再在72℃延伸反應7-10min。

4.按權利要求2所述的交叉保護性疫苗抗原制備方法，其特征在于：所述步驟2)含氨芐青霉素、Xgal、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB培養基中含有100μg/ml氨芐青霉素、40μg/ml?Xgal和24μg/ml異丙基-β-D-硫代半乳糖苷。?

5.按權利要求2所述的交叉保護性疫苗抗原制備方法，其特征在于：所述步驟3)中純化重組蛋白過程為將離心收集上清裂解液于聚丙烯酰胺凝膠電泳，取下凝膠，用0.1M的KCl染色直至膠塊上現出透明條帶為止，將透明區域切割置于含有6ml蛋白電泳緩沖液的透析袋中，120伏電壓進行蛋白質水平電泳2小時，取出透析袋放入1000ml?PBS中于4℃進行透析三次，透析完畢后將透析袋取出吸出溶液，而后超濾管離心，收集上清液即為重組交叉保護性疫苗抗原VhdQ。

6.按權利要求5所述的交叉保護性疫苗抗原制備方法，其特征在于：所述透析袋放入預冷的PBS中透析時，每5小時后換一次PBS；超濾管離心條件為6000g，4℃下離心10-20min。?