[發明專利]歐、美型豬繁殖與綜合癥病毒抗體鑒別診斷試劑盒的制備方法

無效

• 申請號: 200810014057.1
• 申請日: 2008-01-23
• 公開（公告）號: CN101236205A
• 公開（公告）日: 2008-08-06
• 發明（設計）人: 王金寶;張禎濤;李俊;任慧英;吳家強;張秀美;叢曉燕;溫建新;周順
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 濟南信達專利事務所有限公司
• 代理人: 姜明

1、技術領域

本發明涉及生物技術領域內的獸病診斷技術，具體是一種歐、美型豬繁殖與綜合癥病毒抗體鑒別診斷試劑盒的制備方法。

2、背景技術

PRRS的發生和流行，已給我國的養豬業造成了相當大的經濟損失。但是目前，對該病的預防與控制仍是世界各國所面臨的難題。為了更好地預防和控制本病的發生和流行，當務之急是要建立一種可靠的、適于大規模診斷與檢測PRRS的方法。PRRS感染常用的診斷方法有細胞培養、RT-PCR。但是，這些診斷方法在應用中耗時長、工作量大、需要特殊的儀器和設備，遠遠不能滿足當前診斷PRRS感染的需要，尤其不適合大規模的臨床樣本檢測與開展流行病學調查。

PRRSV分為美洲型與歐洲型兩種基因型，歐洲地區主要流行歐洲型，而美洲及亞太地區則以美洲型為主。目前，我國所分離獲得的毒株大多數屬于美洲型，趙耘等通過分子生物學及血清學方法鑒定了一株歐洲型PRRSV，預示現在我國豬群中可能同時存在歐、美型PRRSV。二者的ORF7編碼的病毒結構蛋白都具有良好的抗原性，且N蛋白核苷酸序列型內保守，型間差異較大。因此，本研究在N蛋白的基礎上剔除了歐、美型PRRSV型間保守的抗原表位，利用原核表達的融合蛋白作為抗原，建立一種適用于大規模檢測PRRS抗體的間接ELISA方法，首次在國內人工合成了歐洲型PRRSV?N蛋白型特異性抗原表位，建立了檢測歐洲型PRRSV抗體的ELISA方法；以期為我國PRRS的診斷與檢測和血清學調查提供快捷的技術手段。

3、發明內容

本發明的目的是研制一種能夠區分歐、美洲型的PRRS抗體檢測試劑盒，最終為大規模的臨床樣本檢測與開展流行病學調查提供一種有效的試劑盒。

本發明專利是通過以下技術方案實現的：

1)目的蛋白的表達及純化：

PRRSV?VR-2332的ORF7基因中歐、美型毒株的保守表位25aa～30aa，37aa～52aa及50aa～66aa的基因缺失，構建了針對美洲型PRRSV?N蛋白的原核表達載體pGEX-6P-1-N；針對歐洲型PRRSV?N蛋白表位2aa～12aa、40aa～46aa及67aa～128aa的核酸序列，建立了針對歐洲型PRRSV?N蛋白的原核重組表達載體PQE30-N，利用純化試劑盒進行蛋白純化。

2)歐、美型PRRSV抗體檢測間接ELISA方法的建立：

利用純化的美洲型及歐洲型PRRSV?N蛋白分別建立間接ELISA方法，確定了美洲型N蛋白抗原包被濃度為4.5μg/mL，歐洲型N蛋白抗原包被濃度為8μg/mL；抗原包被條件均為37℃1h加4℃包被過夜；血清的稀釋度均為1∶40，30min作為美洲型N蛋白包被時血清的最適工作時間，60min作為歐洲型N蛋白包被時血清的最適工作時間；均使用1％的BSA封閉，HRP-兔抗豬IgG的使用濃度均為1∶1000，結合時間均為30min；美洲型N蛋白包被時，樣本OD450≥0.43，判定為陽性；OD450值＜0.43的判定為陰性；歐洲型N蛋白包被時，樣本OD450≥0.40，判定為陽性；OD450值＜0.40的判定為陰性。不論何種抗原包被，對豬瘟、偽狂犬病、豬乙型腦炎、豬細小病毒病陽性血清的OD450值均小于0.40，均為陰性，表明該重組蛋白抗原與豬瘟、偽狂犬病、豬乙型腦炎、豬細小的陽性血清沒有交叉反應，說明ELISA方法具有良好的特異性，均可以用于PRRS抗體的檢測。

歐洲型PRRSV陽性血清與美洲型N蛋白包被板發生交叉反應，美洲型PRRSV陽性血清與歐洲型N蛋白包被板也發生交叉反應，兩者OD450值均略高于陰陽性臨界值，但都遠低于同型血清與同型抗原的反應值，表明所建立的針對歐洲型及美洲型PRRSV的間接ELISA方法可區分歐洲型及美洲型毒株的感染，但需進一步優化待檢血清稀釋度，使交叉反應的OD450均低于陰陽性臨界值。

本發明的方發所具有的積極效果是，由于國內目前為止尚未發現歐洲型PRRSV感染，獲得的歐洲型PRRSV陽性血清的量有限，交叉反應問題暫時還未得到解決。檢測歐洲型PRRSV感染的ELISA檢測方法的建立為豬病檢測提供了技術儲備。

4、附圖說明

附圖1是重組蛋白GST-N的純化產物；

圖中1：為全分子量蛋白質標準；2：為包涵體溶解后的上清；3～5：為過柱純化后的蛋白。

附圖2是重組蛋白HIS-N的純化產物；

圖中1低分子量蛋白Marker，2～5分別為親和層析純化收集第4管、第3管、第2管、第1管蛋白。

附圖3是重組蛋白GST-N的Western-Blot分析；