[發明專利]人卵母細胞序列玻璃化冷凍液和融解液

無效

• 申請號: 200810013783.1
• 申請日: 2008-01-15
• 公開（公告）號: CN101215548A
• 公開（公告）日: 2008-07-09
• 發明（設計）人: 陳子江;李媛;趙躍然
• 申請（專利權）人: 山東省立醫院
• 主分類號: C12N5/08
• 分類號: C12N5/08
• 代理公司: 濟南信達專利事務所有限公司
• 代理人: 姜明

技術領域

本發明涉及生物學中的細胞保存領域，具體地說是一種人卵母細胞序列玻璃化冷凍液和融解液。

背景技術

玻璃化冷凍技術是生物學領域中針對各種卵細胞及胚胎的保藏技術。人卵母細胞的玻璃化冷凍保存是建立人類卵子庫，為廣大不孕患者解決生育力保存的重要技術手段。現有技術中應用于人卵細胞的玻璃化冷凍液和融解液雖然有許多種，但是還沒有一種獲得大家的公認，可以得到穩定的很好的復蘇效果。如，在冷凍液中常用到1.2-丙二醇(PROH)和乙烯乙二醇(EG)為保護劑，而其濃度高達15％。這類冷凍液主要存在以下不足：一、高濃度導致了較高的毒性，對卵母細胞冷凍復蘇后應用于人類生殖目的的安全性造成了威脅；二、卵母細胞冷凍復蘇后獲得的胚胎的質量下降，不能獲得令人滿意的臨床妊娠率。

發明內容

本發明的技術任務是針對上述現有技術的不足，提供一種毒性低、保藏效果好的人卵母細胞序列玻璃化冷凍液和融解液。

本發明的技術任務是按以下方式實現的：人卵母細胞序列玻璃化冷凍液和融解液，其特點是，

基礎液：在含有HEPES的人輸卵管液(mHTF)中添加10％人血蛋白；

冷凍液一：基礎液中添加10％Ficoll?70和6.5mol/L蔗糖；

冷凍液二：基礎液中添加10％Ficoll?70、6.5mol/L蔗糖、10％乙二醇和7.5mol/L二甲亞砜；

融解液一：基礎液中添加1.0mol/L蔗糖；

融解液二：基礎液中添加0.6mol/L蔗糖；

融解液三：基礎液中添加0.3mol/L蔗糖；

融解液四：基礎液中添加0.15mol/L蔗糖。

本發明的人卵母細胞序列玻璃化冷凍液和融解液與現有技術相比具有以下突出的有益效果：

(1)通過添加Ficoll?70，降低了乙二醇和二甲亞砜的濃度，也就是大大減少了冷凍液的毒性；

(2)能夠保證冷凍復蘇效果，即獲得良好的復蘇成活率，獲得具有良好發育潛能的胚胎，更適用于建立人卵子庫，并將復蘇后卵母細胞應用于患者妊娠之用；

(3)融解液采取低濃度、多次替換，可以逐漸將高濃度的冷凍保護劑逐級替換出來，避免卵母細胞在較大濃度梯度的液體轉換中，細胞質水份的過度變化造成細胞的死亡，從而提高復蘇后細胞的成活率和發育潛能。

具體實施方式

參照以下具體實施例對本發明的人卵母細胞序列玻璃化冷凍液和融解液作詳細地說明，但不以任何形式限制本發明。

實施例：

(一)冷凍液和融解液的配制：

基礎液：

在100ml含有HEPES的人輸卵管液中添加10ml人血蛋白；

冷凍液一：

在9ml基礎液中添加1ml?Ficoll?70和0.065mol蔗糖

冷凍液二：

在8ml基礎液中添加1ml?Ficoll?70、0.065mol蔗糖、1ml乙二醇和0.075mol二甲亞砜；

融解液一：在10ml基礎液中添加0.01mol蔗糖；

融解液二：在10ml基礎液中添加0.006mol蔗糖；

融解液三：在10ml基礎液中添加0.003mol蔗糖；

融解液四：在10ml基礎液中添加0.0015mol蔗糖。

(二)冷凍液和融解液的使用方法

冷凍時，將待冷凍保存的卵母細胞首先放入基礎液中平衡5min，再入冷凍液一3min；再入冷凍液二，馬上用Cryoloop(市售的用于玻璃化冷凍的承載器具，開放式)沾取體積不超過1uL的冷凍液二，在Cryoloop的環上形成一個薄膜，后將卵母細胞點在薄膜上，時間約20～30s，卵母細胞不超過3個，隨后投入液氮中保存。

融解時，將Cryoloop拿出液氮后，直接將其放入融解液一，其上所帶的卵母細胞馬上會沉入融解液中，再逐次轉入融解液二、三、四，時間各30～60S。最后轉入普通卵母細胞培養液備用進行體外受精。融解過程完成。

發明人利用上述冷凍液及融解液將197個人卵母細胞玻璃化冷凍保藏1～6個月后融解，共存活169個(85.8％)，受精122個(72.2％)，卵裂72個(59.0％)，獲得優質胚胎41個(33.6％)，移植6例，其中4例為自身卵母細胞移植，2例為卵巢早衰患者接受供卵移植。平均移植胚胎數2.5±0.6個，共獲得臨床妊娠2例(33.3％)。各項指標均令人滿意，證明本發明的冷凍液和融解液具有良好的冷凍復蘇效果。