[發(fā)明專利]紫花苜蓿解旋酶基因及其克隆與應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810013675.4
• 申請日: 2008-01-24
• 公開（公告）號: CN101402962A
• 公開（公告）日: 2009-04-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張憲省;高新起;羅琰
• 申請（專利權(quán)）人: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N15/10;A01H1/00
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• 代理人: 暫無信息

(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及紫花苜蓿中解旋酶基因MH1的克隆、重組及耐逆功能的分析和應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域。

(二)背景技術(shù)

干旱、鹽堿等不良環(huán)境條件在世界范圍內(nèi)嚴(yán)重影響作物的生長和產(chǎn)量。因此，提高作物的耐逆能力愈來愈受到人們的重視。解旋酶在植物耐逆過程中的作用是近幾年才被發(fā)現(xiàn)的，是一種新的植物耐逆途徑。研究表明過量表達(dá)某些解旋酶基因可以提高轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽和耐低溫能力。與傳統(tǒng)耐逆途徑的區(qū)別在于，它有可能直接作用于脅迫敏感的遺傳信息轉(zhuǎn)錄翻譯過程。這大大促進(jìn)了耐逆基因工程方面的研究工作，并取得突破性進(jìn)展。2005年N.Sanan-Mishra等利用基因工程手段在煙草中過量表達(dá)豌豆來源的基因PDH45(Pea?DNAhelicase?45)，在不影響轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)量的同時(shí)極大的提高了其耐鹽能力，轉(zhuǎn)基因植株可以在含300mM?NaCl的培養(yǎng)基上正常生長(N.Sanan-Mishra，X.H.Pham，S.K.Sopory?and?N.Tuteja，Pea?DNA?helicase?45?overexpression?intobacco?confers?high?salinity?tolerance?without?affecting?yield，Proc.Natl.Acad.Sci.USA?102(2005)，pp.509514.)。

由于解旋酶基因在植物耐逆過程中所起的作用，本發(fā)明人利用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)，從常用豆科牧草紫花苜蓿中分離編碼解旋酶的基因MH1，利用半定量RT-PCR的方法分析了不同逆境脅迫條件下該基因的表達(dá)情況。構(gòu)建正義表達(dá)載體，利用花序浸染法轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的耐旱、耐鹽和抗氧化脅迫能力得到了顯著提高。該基因可用于雙子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化，提高其耐旱、耐鹽能力。

(三)發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明首次從紫花苜蓿中分離出解旋酶基因MH1的全長cDNA，半定量RT-PCR分析表明該基因的表達(dá)受不同逆境脅迫的誘導(dǎo)。將其連接到表達(dá)載體pBI121上，轉(zhuǎn)化擬南芥，轉(zhuǎn)基因植株在種子萌發(fā)、幼苗生長和以后的生長發(fā)育過程中耐旱、耐鹽和抗氧化脅迫能力都得到了提高。

該基因的全長cDNA為1609bp，其中開放閱讀框部分為1221bp，由此推得含有406個(gè)氨基酸的一段序列，用DNAMan軟件將MDH基因編碼的氨基酸序列與GenBank中登記的序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，該序列與豌豆、煙草、擬南芥解旋酶序列有較高的同源性。MDH具有DEAD-box家族的所共有的九個(gè)基序Q、I、Ia、Ib、II、III、IV、V和VI，屬于DEAD-box解旋酶家族。(見附圖1)。表明經(jīng)過上述克隆步驟得到了紫花苜蓿中編碼DEAD-box解旋酶的基因。該基因的序列如下：

序列表

(1)SEQ?ID?NO?1的信息

(a)序列特征

*長度：1609堿基對

*類型：核酸

*鏈型：雙鏈

*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)：線性

(b)分子類型：cDNA

(c)假設(shè)：否

(d)反義：否

(e)最初來源：紫花苜蓿

(f)序列描述：

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