[發明專利]豬繁殖與呼吸綜合癥滅活濃縮疫苗“SD1株”的制備方法

無效

• 申請號: 200810013674.X
• 申請日: 2008-01-24
• 公開（公告）號: CN101234198A
• 公開（公告）日: 2008-08-06
• 發明（設計）人: 王金寶;吳家強;張秀美;李俊;任慧英;溫建新;周順;徐龍濤;禚寶山
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: A61K39/12
• 分類號: A61K39/12;C12N7/06;A61P31/12;A61P15/00;A61P11/00
• 代理公司: 濟南信達專利事務所有限公司
• 代理人: 姜明

1、豬繁殖與呼吸綜合癥滅活濃縮疫苗“SD1株”的制備方法，其特征在于由水相和油相按33％∶67％重量百分比配制而成：其中水相，是由滅活20小時、濃縮2倍的美洲型豬繁殖與呼吸綜合癥“SD1株”病毒培養液96份，加入4份吐溫-80，充分混勻而成；水相占疫苗總量的33％；油相，是由94份10號白油和6份司本-80混合，再按油相總量加入2％硬脂酸鋁攪拌至透明，于116℃高壓滅菌制成，油相占疫苗總量的67％；

制備步驟如下：

a生產用毒種制備；制苗用毒種為豬繁殖與呼吸綜合癥病毒PRRSV“SD1株”，美洲型(B型)，將PRRSV“SD1株”以含2.5％小牛血清的MEM作十倍遞進稀釋，取10^-3，10^-4，…，10^-86個稀釋度，分別接種已經長成單層的Marc-145細胞，每個稀釋度接種8孔，0.1mL/孔，同時設不接毒對照，連續觀察5-7d，記錄每個稀釋度出現CPE的孔數，按Reed-Muench法計算半數細胞培養物感染量(TCID₅₀)，每毫升病毒含量應≥10^7.0TCID₅₀；

b、病毒增殖和制苗材料的制備：將MEM配制成除菌濾過溶液，以7.5％NaHCO₃調pH至7.2-7.4，加入8％新生牛血清、100μ/mL青霉素和鏈霉素，混勻，配制成生長液，維持液的血清含量為2.5％，其他成分與生長液相同，取長成單層的Marc-145細胞，傾去生長液，加入適量0.025％胰蛋白酶與EDTA消化分散液(pH7.6-8.0)，于37℃消化至貼壁細胞分散，倒去殘余液后加入生長液進行吹打、分散細胞，然后調整細胞密度為10-15萬/mL，分裝后置37℃培養，轉瓶培養時轉速為6-8轉，約48h形成細胞單層；

c、病毒接種：將細胞瓶內的生長液棄去，接種1％PRRSV“SD1株”，37℃吸附30min，然后加入維持液，置37℃繼續培養，每天觀察細胞變化與CPE情況，當CPE達80％左右時收毒，反復凍融3次后混勻病毒懸液，抽取小樣，用96孔細胞培養板測定，病毒含量應≥10^7.0TCID₅₀/mL。置-20℃保存；

d、病毒滅活；向病毒液中加入終濃度為0.1％的甲醛溶液，充分混勻后置37℃滅活20h，其間每隔4-6h搖動病毒懸液一次，并更換瓶塞；

e、病毒濃縮；采用美國PALL濃縮儀將滅活后的病毒濃縮2倍；

f、半成品檢驗

1)無菌檢驗：對滅活病毒液按《中國獸藥典》附錄第15頁進行檢驗，應無細菌生長；

2)滅活檢驗：取滅活毒液，用0.2％的焦亞硫酸鈉作為中和劑終止滅活，接種長成單層的Marc-145細胞，換成維持液，逐日觀察細胞形態，連續6d，應不出現CPE；盲傳一代，亦不應出現CPE；

g、疫苗配制

先配制油相，將94份10號白油和6份司本-80混合，再按總量加入2％硬脂酸鋁隨加隨攪拌至透明為止，116℃高壓滅菌后，取占疫苗總量67％的油相加入膠體磨中，開動電機慢速轉動攪拌，在攪動油相的同時，緩慢地加入占疫苗總量33％的水相，加完后再以10000r/min攪拌3-5min，在終止攪拌前加入0.01％硫柳汞，水相由滅活20小時、濃縮2倍的美洲型豬繁殖與呼吸綜合癥“SD1株”病毒培養液96份，加入4份吐溫-80，充分混勻而成；

h、成品檢驗，包括：

1)物理性狀；

2)無菌檢驗；

3)甲醛、硫柳汞含量測定；

4)安全檢驗；

5)效力檢驗包裝既為成品。