[發明專利]共表達PRRSV ORF3及ORF5雙基因核酸疫苗的制備方法

無效

• 申請號: 200810013673.5
• 申請日: 2008-01-24
• 公開（公告）號: CN101219216A
• 公開（公告）日: 2008-07-16
• 發明（設計）人: 王金寶;任慧英;李俊;張秀美;溫建新;周順;李文立;張樂萃;宋春陽
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院畜牧獸醫研究所;青島農業大學
• 主分類號: A61K39/295
• 分類號: A61K39/295;C12N15/34;C12N15/40;C12N15/85;A61P31/12;A61P15/00;A61P11/00
• 代理公司: 濟南信達專利事務所有限公司
• 代理人: 姜明

(一)技術領域

本發明涉及一種生物技術高新科技領域，共表達豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)ORF3及ORF5雙基因核酸疫苗，用于對豬提供針對豬繁殖與呼吸綜合征病毒的免疫保護作用。

(二)背景技術

豬繁殖與呼吸綜合征可引起妊娠母豬流產、死產等繁殖障礙和仔豬呼吸道癥狀。自2006年6月初以來，在我國湖北、湖南、江西、安徽等十幾個省份相繼出現高致病性PRRSV為主要病原的豬“無名高熱綜合征”，給我國的養豬業造成了嚴重的經濟損失。豬繁殖與呼吸綜合征病毒為單股正鏈RNA病毒，長約15kb。ORF3編碼分子量為40～50ku的糖蛋白GP3，GP3在豬體內并不能刺激產生中和抗體，但它可通過細胞免疫為母豬提供一定的保護；ORF5編碼約25ku的糖蛋白GP5，能誘導機體產生中和抗體及特異性細胞免疫。目前用于預防PRRS的弱毒苗和滅活苗已在我國廣泛應用，但是豬繁殖與呼吸綜合征仍未得到有效控制。核酸疫苗可將病毒保護性抗原的基因以質粒的方式導入動物體，其表達蛋白既可刺激產生體液免疫又可產生細胞免疫，本發明中將PRRSV?ORF3及ORF5基因同時插入真核重組表達載體構建的核酸疫苗尚未見報道。

(三)發明內容

本發明的目的是研制一種能夠有效控制豬繁殖與呼吸綜合征的共表達PRRSV?ORF3及ORF5雙基因的核酸疫苗，使豬繁殖與呼吸綜合征難以防治的現狀得以突破。

本發明的目的是這樣實現的：

在哺乳動物真核表達載體的2個多克隆位點中分別插入了PRRSV?ORF3及ORF5完整基因，獲得共表達PRRSV?ORF3及ORF5雙基因的核酸疫苗，該核酸疫苗可在哺乳動物細胞中同時表達PRRSV的GP3及GP5蛋白。

上述核酸疫苗通過以下方法構建而成：

1)ORF3及ORF5的擴增

根據PRRSV美洲標準毒株ATCC?VR-2332的基因序列，設計了針對PRRSV山東省分離株SD1株ORF3及ORF5的引物，引物序列如下：

ORF3的引物S1：5’-ATCGCTAGCCGCCACCATGGTTAATAGCTGTA-3’

S2：5’-GAGGAATTCAGAAGAATGTAAATAATTCTCATCTG-3’

預期擴增長度為852bp。

ORF5的引物W1：5’-AATCTAGAGCCGCCACCATGTTGGA-3’

W2：5’-GCGCGGCCGCTCACTGGCGTGTAG-3’

預期擴增長度為702bp。

以SD1株的cDNA為模板，通過引物S1及S2擴增ORF3，通過W1及W2擴增ORF5基因。

2)S-W-PIRES真核重組表達載體的構建

將ORF5的PCR產物W片段與pIRES重組質粒經Xba?I和Not?I雙酶切，將ORF5插入pIRES，構建W-pIRES重組質粒。將W-pIRES及ORF3的PCR產物S片段經EcoR?I和Nhe?I雙酶切后，將ORF3的PCR產物S片段插入W-pIRES，構建S-W-PIRES真核重組表達載體。

3)S-W-PIRES真核重組質粒的轉染

將S-W-PIRES轉染COS1細胞，通過RT-PCR檢測ORF3及ORF5的轉錄情況，通過免疫組化檢測目的蛋白的表達情況。上述試驗均證明了目的基因的轉錄及目的蛋白的表達。

4)S-W-PIRES真核重組質粒的動物試驗

將S-W-PIRES質粒免疫小鼠及豬，同時設空載體PIRES及生理鹽水對照組，檢測核酸疫苗免疫后動物體內針對GP3及GP5的ELISA抗體、中和抗體及淋巴細胞增殖反應。上述試驗均證明了核酸疫苗S-W-PIRES在動物體內均可刺激產生針對GP3及GP5的抗體，中和抗體效價可達1∶18.4以上，淋巴細胞增殖能力明顯高于對照組。

該核酸疫苗首次在哺乳動物細胞真核表達載體中插入了PRRSV?ORF3及ORF5基因，突破了PRRSV常規滅活疫苗及弱毒疫苗的局限性，避免了弱毒疫苗使用后毒力返強情況的發生，彌補了滅活疫苗免疫后不能產生細胞免疫的缺陷，又可使針對GP5的抗體優先產生，改變了PRRSV感染后針對GP5的中和抗體產生慢而且產生量少的不足。該核酸疫苗可在動物體內持續不斷的產生GP3蛋白及GP5蛋白，使機體不斷產生針對兩者的體液免疫及細胞免疫，對豬體提供持久的免疫保護力，在PRRS的防控中具有廣闊的應用前景。

4、實施例

1)PCR引物設計合成