[發明專利]一種直接產生妥布霉素的工程菌及其應用

有效

• 申請號: 200810011472.1
• 申請日: 2008-05-20
• 公開（公告）號: CN101392229A
• 公開（公告）日: 2009-03-25
• 發明（設計）人: 夏煥章;隋鑫;余永紅;侯曦凡
• 申請（專利權）人: 沈陽藥科大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P19/00;A61K31/702;A61P31/04;C12R1/465
• 代理公司: 沈陽杰克知識產權代理有限公司
• 代理人: 李宇彤

技術領域

本發明屬于抗生素制藥領域，涉及一種直接產生妥布霉素的工程菌及其應用，具體地說，本發明是利用分子生物學操作技術，阻斷黑暗鏈霉菌(Streptomyces?tenebrarius)生物合成基因tacA，獲得直接產生妥布霉素的基因工程菌株，可以在抗生素制藥中應用。?

背景技術

黑暗鏈霉菌(Streptomyces?tenebrarius)是1967年美國禮萊公司的研究人員從土壤中分離得到的，該菌株能產生一組抗生素，其中2、4、5’為主組分。組分2為安普霉素(Apramycin，Am)，組分4為6”-O-氨甲酰卡那霉素B(6”-O-Carbamoylkanamycin?B，CKB)，組分5’為6”-O-氨甲酰妥布霉素(6”-O-Carbamoyl?tobramycin，CTB)。組分4、5’經高溫水解后分別形成卡那霉素B和妥布霉素。?

妥布霉素是一種廣譜高效的抗生素，在體外對多種細菌有抗菌活性，特別是某些對慶大霉素耐藥的銅綠假單孢菌有效，而且妥布霉素的耳、腎毒性相對較低，是臨床上廣泛應用的抗菌藥。?

多年來科研工作人員對黑暗鏈霉菌的研究主要集中于常規誘變育種和優化生產工藝等方面取得一些進展。二十世紀八十年代興起的鏈霉菌基因工程研究，已在抗生素生物合成基因的克隆、產量提高、組分改善及雜合抗生素生產等方面取得長足的進步。在分子水平，李天伯等克隆到一段50Kb區域，證明其中含有參與妥布霉素合成的dTDP-葡萄糖-4，6-脫水酶。Madan?Kumar?Kharel等利用同源雜交的方法克隆到一段13.8Kb氨甲酰妥布霉素生物合成基因簇，證明了其中tbmA、tbmB的基因功能，推斷出氨甲酰妥布霉素的生物合成途徑。?

目前，妥布霉素的生產方法是從黑暗鏈霉菌發酵液中分離得到氨甲酰妥布霉素，再經堿性條件下高溫水解獲取妥布霉素。該方法的缺點是雜質多，產品收率低，生產成本高。?

隨著分子生物學技術的發展，使得利用基因工程的方法改造抗生素組分成為可能。Madan?Kumar?Kharel等克隆到黑暗鏈霉菌中妥布霉素部分合成基因簇，Blastn發現其中基因TacA為氨甲酰基轉移酶，可能與6”位氨甲酰基合成有關。?

發明內容

本發明的目的是通過對tacA失活的方法，獲得能直接產生妥布霉素的工程菌，該菌株已于2008年3月20日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCC?No.2409。?

本發明通過框架內刪除失活的方法阻斷黑暗鏈霉菌中tacA基因，主要包括以下幾個步驟：?

A、tacA基因阻斷質粒的構建；?

B、阻斷質粒轉化黑暗鏈霉菌；?

C、轉化子的篩選；?

D、新組分妥布霉素的鑒定。?

框架內刪除失活的方法為PCR分別獲得tacA基因上下游分子量不低于500bp兩個片段，將兩者同時連接到pIJ2925中，再往片段的一端連入在黑暗鏈霉菌中能表達的抗生素抗性基因如紅霉素抗性基因ermE，利用BglII酶切將三個基因片段連到穿梭載體pHZ132中。?

其中轉化是以E.coliET12657(pUZ8002)介導的結合轉移方法。篩選為先篩選紅霉素抗性(erm^R)菌株，無藥傳代后再從中篩選到紅霉素敏感(erm^S)菌株，從中篩選到產新組分的轉化子。鑒定為發酵濾液采用薄層層析TLC、新組分采用MS分析和HPLC-ELSD。?

本發明既簡化了生產工藝、又降低了生產成本，同時也更便于進行產品的質量控制。?

本發明所述菌株已于2008年3月20日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所)登記保藏，其分類命名為黑暗鏈霉菌(Streptomyces?tenebrarius)，保藏編號為CGMCC?No.2409。?

附圖說明

圖1是tacA基因雙交換原理及酶切位點示意圖?

圖2是基因工程菌發酵產物組分TLC分析?

1為妥布霉素標準品，2為黑暗鏈霉菌H6(pSPU303-3)，3為野生型菌株黑暗鏈霉菌H6。A為氨甲酰妥布霉素，B為妥布霉素，C為安普霉素。?

圖3是妥布霉素標準品和新組分的HPLC-ELSD圖譜?

A為妥布霉素標準品，B為新組分?

圖4是新組分的質譜分析圖譜?