[發明專利]一種以高效氯氟氰菊酯為底物的降解菌株的篩選方法

有效

• 申請號: 200810010695.6
• 申請日: 2008-03-19
• 公開（公告）號: CN101538605A
• 公開（公告）日: 2009-09-23
• 發明（設計）人: 張惠文;王秀娟;李旭;蘇振成;張曉黎;張成剛
• 申請（專利權）人: 中國科學院沈陽應用生態研究所
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C12N1/02
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司
• 代理人: 許宗富;周秀梅

技術領域

本發明屬于生物降解農藥殘留領域，具體的說是一種以高效氯氟氰菊酯為底物的降解菌株的篩選方法。

技術背景

高效氯氟氰菊酯商品名為功夫菊酯，屬于擬除蟲菊酯類殺蟲劑中含氟的一種新型農藥。由于可兼治螨類，并且用量遠遠低于有機磷類殺蟲劑，深受農民的歡迎。

在大量推行該類農藥使用的同時，也發現了其負面效應。根據我國農藥毒性分級標準，功夫菊酯屬中等毒性殺蟲劑。對鳥類低毒，對蜜蜂、蠶、魚類及水生生物劇毒。研究表明，功夫菊酯攻毒可以使鯉魚紅細胞的滲透脆性增加，降低紅細胞膜的流動性，抑制紅細胞ATP酶的活性，使紅細胞形態發生改變，并使紅細胞核的核膜發生溶解。對魚類抗氧化系統損傷作用明顯。蝦體受其影響表現為無氧代謝加強，有氧代謝和酯類降解代謝減弱，正常的物質代謝平衡被破壞，機體所需能量減少，免疫力和抵抗外界環境的能力均明顯降低；由于功夫菊酯影響，有可能誘發蝦病的爆發或導致蝦的大批量死亡。

一般認為功夫菊酯對哺乳類動物是安全的，但是這類化學農藥的大量使用造成了環境的嚴重污染、生態平衡的嚴重破壞，從而危害了人類健康。尤其是谷物、水果、蔬菜等食品中殘留的低濃度農藥進入人體所造成的慢性和亞慢性毒性問題，更不可忽視。為此，相關標準也有了嚴格的規定。歐盟在進口茶葉農殘新標準中，將功夫菊酯殘留量定為1mg/kg。中華人民共和國國家標準GB18406.1-2001農產品安全質量無公害蔬菜安全要求指出，功夫菊酯在葉類菜農藥中最高殘留量為0.2mg/kg。

由于功夫菊酯的大范圍使用，不僅使農田生態系統受損，而且對水生生物也造成了危害。因此，篩選出可以高效率降解功夫菊酯的微生物，降低作物農藥殘留量，減少對水生生物的影響，成為了迫切要求深入探討與解決的問題。

從目前殺蟲劑類微生物降解研究現狀來看，國內外對降解菌株的分離篩選和代謝途徑研究取得了一些進展，但在擬除蟲菊酯類的微生物降解方面研究相對比較薄弱，分離獲得能夠降解擬除蟲菊酯類的菌株很少。相關降解菌劑，酶制劑未見報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種以高效氯氟氰菊酯為底物的降解菌株的篩選方法。

為實現上述目的，本發明所采用的技術方案為：

篩選方法：

1)菌樣的富集馴化：將5-10g菌樣接種于含高效氯氟氰菊酯的80-100ml富集培養基中進行轉接培養，每次轉接培養條件為25-30℃、130-200r/min搖床培養5-10天，共轉接4-7次，轉接量按體積百分比計每次培養液5-10％接種于含高效氯氟氰菊酯逐漸增加的80-100ml富集培養基中，待用；其中高效氯氟氰菊酯首次加入量25mg/L，而后以25-50mg/L逐漸增加，菌樣首次加入富集培養基中同時加入10-20粒玻璃珠；

2)篩選：按體積百分比5-20％的接種量將步驟1)中的富集培養菌液接種于含終濃度為50-150mg/L高效氯氟氰菊酯的60-100ml基礎培養基中，進行轉接培養，每次轉接培養條件為25-30℃下以130-200r/min搖床培養5-10天，共轉接4-7次，得到以高效氯氟氰菊酯為唯一碳源的混合菌液，待用；

3)分離純化：將篩選所得的以高效氯氟氰菊酯為唯一碳源的混合菌液稀釋10⁵-10⁹倍，涂布于普通培養基上，于25-30℃培養2-4天，分別挑取形態不同的菌落在普通培養基上劃線純化；

4)強化：將步驟3)中分離純化好的單一菌株劃線到含終濃度為50-150mg/L的高效氯氟氰菊酯的基礎培養基平板上，在25-30℃下培養3-5天，得到以高效氯氟氰菊酯為底物的降解菌株。

所述富集培養基為蛋白胨8-10g，NaCl?0.8-1.0g，KH₂PO₄?0.8-1.0g，葡萄糖1.0-1.2g，H₂O?1000ml，pH＝6.8-7.2；