[發(fā)明專利]使用固態(tài)pH傳感器的qPCR

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200780052692.2
• 申請日: 2007-03-02
• 公開（公告）號: CN101743319A
• 公開（公告）日: 2010-06-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: C·圖馬佐;S·普魯修撒曼
• 申請（專利權(quán)）人: DNA電子有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N27/414
• 代理公司: 北京潤平知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11283
• 代理人: 周建秋;王鳳桐

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種通過使用pH敏感性的離子敏感場效應(yīng)晶體管(ISFET) 來監(jiān)測擴增過程中的引物延伸階段的質(zhì)子釋放，從而對核酸擴增進行定量的 實時監(jiān)測方法，例如，聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)的擴增、連接酶鏈式反應(yīng)或 轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增。本發(fā)明還提供了用于此目的的包括pH敏感性的離子敏感 場效應(yīng)晶體管(ISFET)的傳感裝置。

背景技術(shù)

定量實時聚合酶鏈式反應(yīng)(qPCR或RT-PCR)已經(jīng)成為實際上用于小量 DNA或RNA擴增的標準方法，例如，用于克隆基因序列、法醫(yī)檢測以及與 疾病有關(guān)的突變的遺傳檢測。qPCR的最具體的實施方式需要標記的探針(例 如，熒光染料)以監(jiān)測擴增子。此處公開的qPCR取消了對標記的探針的需 要。替代地，本方法依賴于對PCR循環(huán)導(dǎo)致的質(zhì)子釋放具有感應(yīng)的pH敏感 性的離子敏感場效應(yīng)晶體管(ISFET)，并由此可以在芯片上進行。

如在公布的國際專利申請WO03/073088中所報道的，發(fā)明人先前發(fā)現(xiàn) ISFETs可以用于監(jiān)測與寡核苷酸鏈末端處的單個核苷酸插入有關(guān)的質(zhì)子釋 放。通過pH敏感性的ISFETs對單個核苷酸插入的監(jiān)測可以用于基于常規(guī)桑 格(Sanger)DNA測序法的DNA測序并可以用于識別等位突變體，例如， 依賴于檢測靶向特異性核酸位點而設(shè)計的寡核苷酸引物的延伸的單核苷酸 多態(tài)性(SNPs)。本發(fā)明得自于發(fā)明人進一步認識到質(zhì)子也是PCR產(chǎn)物，因 此qPCR也可以通過監(jiān)測質(zhì)子釋放的離子敏感場效應(yīng)晶體管(ISFET)來實 現(xiàn)，優(yōu)選在低反應(yīng)體積的室內(nèi)進行。

發(fā)明內(nèi)容

因此，本發(fā)明的一方面提供了一種監(jiān)測樣品中核酸擴增的方法，所述樣 品含有當(dāng)樣品中存在目標(target)序列的情況下用于擴增目標序列的核酸擴 增緩沖混合物，其特征在于，所述監(jiān)測是檢測在目標序列的存在下當(dāng)擴增開 始超過所述樣品的緩沖能力能夠克服的循環(huán)數(shù)閾值時由于質(zhì)子釋放而產(chǎn)生 的pH值的變化，所述檢測使用了傳感裝置，該傳感裝置包括具有傳感表面 的離子敏感場效應(yīng)晶體管(ISFET)和用于檢測來自離子敏感場效應(yīng)晶體管 (ISFET)的電子輸出信號的設(shè)備，所述傳感表面暴露于所述樣品并且被配 置成能夠響應(yīng)在所述晶體管表面的pH值變化而產(chǎn)生電子輸出信號。為了在 監(jiān)測中獲得需要的敏感度，優(yōu)選在小體積(更優(yōu)選納米級體積)內(nèi)以及在低 緩沖能力下進行擴增，從而使釋放的質(zhì)子的數(shù)目導(dǎo)致pH值的快速變化(當(dāng) 超過樣品的緩沖能力時)。因此，這種方法可以方便地在整合有設(shè)置在微流 體(microfluidic)設(shè)備或芯片內(nèi)的pH敏感性的ISFET的納米級反應(yīng)器中實 施。

附圖說明

通過舉例的方式并結(jié)合以下附圖對本發(fā)明的具體實施方式進行描述，其 中：

圖1顯示了使用緩沖的反應(yīng)介質(zhì)在DNA鏈延伸過程中發(fā)生的pH值變 化。

圖2為先前用于DNA測序的場效應(yīng)晶體管的示意圖。

圖3為先前用于DNA測序的成對的場效應(yīng)晶體管的示意圖。

圖4顯示了使用成對的場效應(yīng)晶體管對DNA模板進行桑格(Sanger) 類型的DNA序列測定的結(jié)果示意圖，在反應(yīng)混合物中使用全部所需的 dNTPS和單個ddNTP。

圖5圖示地顯示了導(dǎo)致目標核酸序列的擴增的PCR循環(huán)。

圖6顯示了在DNA序列測定中使用本發(fā)明物而監(jiān)測到的通過DNA延 伸產(chǎn)生的質(zhì)子釋放。

圖7顯示了使用ISFET?pH傳感器的模擬實時定量PCR的結(jié)果。

圖8為顯示了在用于進行qPCR的小體積反應(yīng)室內(nèi)包括嵌入的ISFET的 微流體設(shè)備的示意圖。

圖9為另一種微流體設(shè)備的示意圖，所述微流體設(shè)備用于對具有蓋板20 的反應(yīng)室/孔19內(nèi)的固定樣品進行PCR監(jiān)測。通過加熱元件21可以對芯片 進行加熱，并且能夠依次地被冷卻至各種需要的溫度以用于所述樣品的熱循 環(huán)。

圖10顯示了根據(jù)本發(fā)明的用于進行PCR監(jiān)測的微流體設(shè)備的平面圖和 截面圖，其中，所述樣品流經(jīng)微流體通道22，例如，進入丙烯酸或甲基丙烯 酸甲酯平臺，所述樣品連續(xù)地穿過維持在分別用于DNA變性、引物雜交至 標靶上以及引物延伸的不同溫度下的硅芯片基底23的區(qū)域。顯示了用于樣 品進行PCR的熱循環(huán)的三個溫度區(qū)域。