[發明專利]分枝桿菌樣微生物的捕獲

無效

• 申請號: 200780048444.0
• 申請日: 2007-11-23
• 公開（公告）號: CN101573621A
• 公開（公告）日: 2009-11-04
• 發明（設計）人: S·M·威爾森;C·J·斯坦利
• 申請（專利權）人: 米克羅森斯醫療技術有限公司
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所
• 代理人: 羅菊華

本發明涉及疏水性微生物例如分枝桿菌(mycobacteria)至表面的捕獲和涉及隨后的處理例如就它們的存在或鑒定進行的分析。?

病原性分枝桿菌是形成人和動物中的幾種嚴重傳染性疾病的原因。分枝桿菌的特征在于包含分枝菌酸(mycolic?acid)或相關化合物的疏水性蠟質外膜。分枝菌酸是復雜的羥基化支鏈脂肪酸，通常具有鏈長度在C_77-80的范圍內的烴鏈，其在樣品處理中產生嚴重的問題，引發細菌成簇從而形成索狀物以及促使細菌漂浮在液體的表面和抵抗離心。烴鏈可以包含或可以不包含零星的含氧基團(oxygenated?group)例如羥基、甲氧基、酮基或羧基。病原性分枝桿菌包括為TB的致病因子的結核分枝桿菌(Mycobacterium?tuberculosis)、為AIDS患者中的條件致病菌的MAC復合體的分枝桿菌(主要地鳥分枝桿菌(M.avium)和胞內分枝桿菌(M.intracellulare))、引起腸炎的副結核分枝桿菌(M.Paratuberculosis)、引起麻風病的麻風分枝桿菌(M.leprae)、堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii)、海分枝桿菌(M.marinum)、偶發分枝桿菌(M.fortuitum)復合體和許多其他種類。還存在許多其他非病原性分枝桿菌，包括恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)。同樣，含分枝菌酸放線菌(mycolata)家族的其他成員具有相似的疏水性外膜組分。在一些情況下，其疏水性脂肪酸的鏈長度比分枝桿菌中的短，為大約50個碳原子，在其他情況中為大約30個碳原子。?

為了診斷分枝桿菌感染例如結核病，必須通過顯微鏡檢查法、培養或分子方法例如PCR來證明所述生物的存在。雖然可直接從生物樣品進行顯微鏡檢查法，但更常見地在分析之前首先從生物樣品分離和濃縮分枝桿菌。生物樣品可包括痰、尿、血液、支氣管灌洗物(bronchial?lavage)等。送去診斷的一種最常見的樣品類型是痰。痰存在細菌學的獨特問題。痰在性質上是異質的(heterogenous)，其可以是帶血的、化膿的(purulent)和粘性的。其還可被其他微生物例如假單胞菌(Pseudomonas)污染。?

通常，使痰變稀，同時通過使用各種預處理來去除污染。這些處理包括在N-乙酰L-半胱氨酸、十二烷基硫酸鈉、草酸或磷酸三鈉存在或不存在的情況下使用0.25-0.5M的氫氧化鈉。處理時間可以為20至120分鐘。這些處理經設計用于使痰變稀和殺死大部分污染性微生物。分枝桿菌具有厚的蠟質外膜并且更能抵抗此類處理。雖然如此，據估計達到60％的結核分枝桿菌被該處理殺死或變得不能存活。此外，因為結核分枝桿菌和該家族的其他成員生長如此緩慢，以至于未被該處理殺死的污染性生物的生長仍然是個問題，即高百分比的培養物被快速生長的污染物過度生長。?

在用強烈的去污染劑處理后，對樣品進行離心以濃縮分枝桿菌，其然后通過顯微鏡檢查法、培養或分子擴增來進行分析。該離心步驟引入了感染實驗室工作人員的風險，因為任何在離心過程中爆裂或破裂的試管中的內容物可成霧狀散開并且污染環境。離心還引入樣品處理的瓶頸，因為任何一次只能離心有限量的樣品。此外，離心使所有材料(所述材料被強烈的去污染過程變性并且變得不能溶解)成團狀，并且可獲得對顯微鏡檢查法或分子方法造成問題的非常大的團狀物。?

由于上面所列的關于現有的去污染和濃縮方法的問題，因而如果可直接從生物樣品捕獲分枝桿菌，則將是非常有用的。如果該方法除去一些或所有污染性生物從而無需化學去污染或可使用較不強烈的條件進行化學去污染，則是非常有益的。這也可增加純化的分枝桿菌的存活和增加隨后檢測的靈敏度。?

在與樣品處理不同的其他應用中，將分枝桿菌與固體表面結合以允許容易地濃縮或操作生物(例如從噬菌體溶液中捕獲和清洗分枝桿菌以除去外源非感染噬菌體或捕獲分枝桿菌并且將其從一種溶液轉移至另一種溶液)也可能是非常有用的。?

之前已提出將分枝桿菌捕獲至固體表面的方法，其包括使用結合的噬菌體或固定在珠粒上的并且用作捕獲劑的噬菌體來源的結合肽?(Stratmann等人；J?Clin?Microbiol.2002?November；40(11)：4244-4250)和包括通過使用抗體涂覆的珠粒從牛奶中分離副結核分枝桿菌(Grant?I.R.等人；Appl?Environ?Microbiol.1998?Sep；64(9)：3153-8)。然而，這樣的方法對于廣泛使用來說太昂貴了(特別在不太發達的國家)，并且可能特異性過高，因為并非所有期望的細菌將被捕獲，并且涉及對蛋白酶、變性和強烈的化學藥品敏感的基于蛋白質的分子。?