[發(fā)明專利]基于泛蛋白修飾的α螺旋區(qū)的人工結(jié)合蛋白

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200780047132.8
• 申請日: 2007-11-15
• 公開（公告）號: CN101563456A
• 公開（公告）日: 2009-10-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 邁克爾·施雷爾姆;埃里克·菲德勒
• 申請（專利權(quán)）人: 希爾蛋白質(zhì)有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C07K14/47;G01N33/50
• 代理公司: 中科專利商標(biāo)代理有限責(zé)任公司
• 代理人: 王 旭

1.用于生成蛋白的方法，所述蛋白選自由“泛蛋白-樣蛋白”蛋白超 家族的蛋白、及其各具有泛蛋白-樣折疊基序的片段或融合蛋白組成的組， 其中所述蛋白由于對在α螺旋區(qū)中的一個或多個氨基酸的修飾而顯示出關(guān) 于試劑的提高的結(jié)合親和性，所述結(jié)合親和性在未修飾的蛋白質(zhì)中不存在 或不以該程度存在，所述方法具有下列步驟：

a)選擇“泛蛋白-樣蛋白”超家族的未修飾蛋白；

b)提供所述未修飾蛋白對其具有低的或不具有結(jié)合親和性的試劑；

c)選擇在包括α螺旋區(qū)的蛋白質(zhì)表面-暴露區(qū)中的氨基酸；

d)優(yōu)選地通過取代、插入、缺失和/或化學(xué)修飾而修飾所選擇的氨基 酸，其中所述α螺旋或相鄰區(qū)域中的至少4個表面-暴露的氨基酸被修飾；

e)使所述修飾的蛋白與步驟b)中提供的試劑相接觸；

f)檢測和分離關(guān)于步驟b)中提供的試劑具有新或增高的結(jié)合親和性 的蛋白，和任選地進行下述步驟：

g)在合適的原核、真核或體外表達(dá)系統(tǒng)中或通過化學(xué)合成生成所述 修飾的蛋白；

h)在生成后通過合適的純化方法分離所述蛋白；和進一步任選地

i)通過重復(fù)步驟d-h)進行所述修飾的蛋白的熟化。

2.按照權(quán)利要求1的方法，其中步驟d)通過化學(xué)合成所述修飾的蛋 白而進行。

3.按照權(quán)利要求1的方法，其中步驟d)中的修飾是通過遺傳工程從 而改變屬于相應(yīng)的修飾蛋白的DNA進行的。

4.按照權(quán)利要求1的方法，其中在步驟d)中構(gòu)建基因文庫。

5.按照權(quán)利要求1的方法，其中在步驟d)中通過隨機誘變進行所選 擇的氨基酸的隨機取代。

6.按照權(quán)利要求1的方法，其中在步驟e)中，與所述試劑的所述接 觸通過合適的選擇方法，優(yōu)選地，噬菌體展示、核糖體展示、mRNA展示、 CIS展示或細(xì)胞表面展示方法、酵母表面展示、細(xì)菌表面展示，特別優(yōu)選 通過噬菌體展示方法進行。

7.按照權(quán)利要求1的方法，其中在步驟f)中，針對所述試劑具有結(jié) 合親和性的蛋白的檢測通過下列方法中的一種或多種進行：ELISA、胞質(zhì) 基因表面共振光譜法、熒光光譜法、FACS、等溫滴定熱量測定或分析式 超速離心法。

8.按照權(quán)利要求1的方法，其中利用本身已知的方法，針對其結(jié)合親 和性、其結(jié)合特異性和/或其他蛋白質(zhì)化學(xué)特性諸如穩(wěn)定性、溶解性、或產(chǎn) 量熟化所述蛋白質(zhì)。

9.按照以上權(quán)利要求中一項或多項的方法，其中所述蛋白以位點-特 異性或隨機方式與至少一種相同或不同特異性的蛋白共價連接，由此獲得 二價、多價或雙特異性蛋白。

10.按照權(quán)利要求1-9中一項或多項的方法，其中選擇用于修飾的蛋 白與人泛蛋白具有至少30％的氨基酸序列同一性，且具有泛蛋白-樣折疊 基序，和/或?qū)儆凇胺旱鞍?相關(guān)蛋白”蛋白家族。

11.按照以上權(quán)利要求中一項或多項的方法，其中選擇用于修飾的蛋 白具有泛蛋白-樣折疊基序并優(yōu)選選自由下列各項組成的的組：SUMO-1、 FAU、NEDD-8、UBL-1、Rub1、APG8、ISG15、URM1、HUB1、GDX、 伸蛋白B、PLIC2(N-端結(jié)構(gòu)域)，人帕金蛋白(N-端結(jié)構(gòu)域)。

12.按照以上權(quán)利要求中一項或多項的方法，其中所述蛋白是人泛蛋 白或其他哺乳動物泛蛋白。

13.按照以上權(quán)利要求中一項或多項的方法，其中所述修飾包括5-10 個氨基酸，優(yōu)選6-8個氨基酸的相鄰區(qū)域，其中優(yōu)選地，其2-4個氨基酸 位于所述α螺旋的表面-暴露區(qū)。

14.按照以上權(quán)利要求中一項或多項的方法，其中所述α螺旋的氨基 酸被修飾，且任選另外地，在位于所述α螺旋外的螺旋上游位置或螺旋下 游位置中的氨基酸被修飾。