[發明專利]制備胰島素樣生長因子-1與聚(乙二醇)的偶聯物的方法

有效

• 申請號: 200780031987.1
• 申請日: 2007-08-29
• 公開（公告）號: CN101511390A
• 公開（公告）日: 2009-08-19
• 發明（設計）人: S·費舍爾;F·赫西;H·克內根;K·朗;F·梅茨格;J·T·雷古拉;C·尚茨;A·肖布馬爾;H·J·舍恩菲爾德
• 申請（專利權）人: 弗·哈夫曼-拉羅切有限公司
• 主分類號: A61K47/48
• 分類號: A61K47/48;C12N15/12;C07K14/65;C12N9/52;C12N15/62
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所
• 代理人: 黃革生;凌 立

1.制備賴氨酸聚(乙二醇)化IGF-I或IGF-I變體的方法，所述變體包 含的選自第27位、第65位和/或第68位賴氨酸的一個或兩個氨基酸獨立 地被另一個極性氨基酸取代，所述聚(乙二醇)化是單聚(乙二醇)化或二聚 (乙二醇)化，且所述聚(乙二醇)具有20至100kDa的總分子量，其特征在 于：

a)培養包含表達載體的原核宿主細胞，所述表達載體含有編碼融合蛋 白的核酸，所述融合蛋白包含的所述IGF-I或IGF-I變體的N末端與前肽 的C末端連接，由此Gly-Pro是IGF-I或IGF-I變體的前兩個氨基酸；

b)所述前肽C末端以氨基酸-Y-Pro終止，其中Y是Pro-Arg-Pro，

c)回收并聚(乙二醇)化所述融合蛋白，

d)用IgA蛋白酶切割所述聚(乙二醇)化的融合蛋白，所述IgA蛋白酶 是來自淋球菌2型的IgA蛋白酶，并

e)回收所述聚(乙二醇)化的IGF-I或IGF-I變體。

2.權利要求1的方法，其特征在于所述前肽由通式 Met-X₁-His_n-X₂-Y-Pro-表示，其中

·Met表示甲硫氨酸

·X₁是鍵、絲氨酸或天冬酰胺

·His是組氨酸

·n是從0至10之間的數字，

·X₂是選自肽SEQ?ID?NO：6-10的接頭肽，

·Pro是脯氨酸，并且

·Y是Pro-Arg-Pro。

3.權利要求1或2的方法，其特征在于所述前肽不包含賴氨酸殘基。

4.權利要求1的方法，其特征在于所述極性氨基酸獨立地是精氨酸、 谷氨酰胺或天冬酰胺。

5.權利要求1的方法，其特征在于所述賴氨酸聚(乙二醇)化的IGF-I 變體在第65位和第68位賴氨酸處被單聚(乙二醇)化或二聚(乙二醇)化。

6.權利要求5的方法，其特征在于所述賴氨酸聚(乙二醇)化的IGF-I 變體是攜帶氨基酸R27、R65、K68的RRK并且所述變體在第68位賴氨 酸處被單聚(乙二醇)化，或所述賴氨酸聚(乙二醇)化的IGF-I變體是攜帶氨 基酸R27、K65、R68的RKR并且所述變體在第65位賴氨酸處被單聚(乙 二醇)化。

7.權利要求5的方法，其特征在于所述賴氨酸聚(乙二醇)化的IGF-I 變體是攜帶氨基酸R27、K65、K68的RKK，并且所述變體在第65位和 第68位賴氨酸處被單聚(乙二醇)化或二聚(乙二醇)化。

8.權利要求5的方法，其特征在于所述賴氨酸聚(乙二醇)化的IGF-I 變體是攜帶氨基酸R27、R65、K68的RRK、攜帶氨基酸R27、K65、R68 的RKR或攜帶氨基酸R27、K65、K68的RKK的混合物，并且所述變體 在第65位和第68位賴氨酸處被單聚(乙二醇)化或二聚(乙二醇)化。

9.權利要求1的方法，其特征在于所述賴氨酸聚(乙二醇)化的IGF-I 被隨機單聚(乙二醇)化或二聚(乙二醇)化。

10.權利要求1的方法，其特征在于所述聚(乙二醇)基團是分支的二聚 (乙二醇)基團。

11.包含賴氨酸聚(乙二醇)化的IGF-I或IGF-I變體的融合蛋白，所述 聚(乙二醇)化是單聚(乙二醇)化或二聚(乙二醇)化，且所述聚(乙二醇)具有 20至100kDa的總分子量，所述賴氨酸聚(乙二醇)化的IGF-I變體包含的 選自第27位、第65位和/或第68位賴氨酸的一個或兩個氨基酸獨立地被 另一個極性氨基酸取代，Gly-Pro是IGF-I或IGF-I變體的前兩個氨基酸， 其特征在于所述賴氨酸聚(乙二醇)化的IGF-I或IGF-I變體N末端與前肽 的C末端連接，所述前肽C末端以氨基酸-Y-Pro終止，其中Y是 Pro-Arg-Pro。