[發(fā)明專利]使用基于UV光的DNA成像細(xì)胞術(shù)來檢測和/或診斷癌癥的體外方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200780024364.1
• 申請日: 2007-05-14
• 公開（公告）號: CN101479602A
• 公開（公告）日: 2009-07-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: B·H·W·亨德里克斯;E·R·福森納爾;G·斯佩克維爾斯;N·C·范德瓦爾特;S·凱珀
• 申請（專利權(quán)）人: 皇家飛利浦電子股份有限公司
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;G01N33/50;G01N33/58;G01N33/574;C12Q1/68;G01N33/487;G06T7/00;G01N15/14
• 代理公司: 永新專利商標(biāo)代理有限公司
• 代理人: 林曉紅

發(fā)明主題

本發(fā)明涉及通過測量細(xì)胞核核酸的UV吸收在體外確定人或動物細(xì)胞 的細(xì)胞核內(nèi)的細(xì)胞核核酸的量的方法。

本發(fā)明還涉及基于細(xì)胞核核酸的UV吸收的體外檢測生物樣品中的癌 細(xì)胞的方法。

本發(fā)明進(jìn)一步涉及基于細(xì)胞核核酸的UV吸收的診斷和/或預(yù)測人或動 物對象體內(nèi)癌癥的體外方法。

發(fā)明背景

癌癥的早期檢測是治療癌癥患者的關(guān)鍵因素。有各種在生物樣品中檢測 癌細(xì)胞，并從而診斷已存在的癌癥或至少估計(jì)未來癌癥發(fā)展的可能性的可能 的選擇。這些不同的方法包括癌組織的物理檢驗(yàn)、癌細(xì)胞的形態(tài)特征檢測、 細(xì)胞結(jié)構(gòu)例如膜和細(xì)胞核的免疫組化染色及特征鑒定、測量腫瘤特異因子的 表達(dá)等等。

檢測癌細(xì)胞的一種可能的選擇是所謂的DNA細(xì)胞術(shù)(DNA?cytometry)， 其測量細(xì)胞核DNA的量以檢測與正常DNA含量的偏離。假設(shè)如果一個(gè)細(xì) 胞(作為突變事件的后果)含有比已知標(biāo)準(zhǔn)(已知為非癌性的，即“健康的”或 “正常的”類型)更少或更多的DNA，那么DNA含量上的這種偏離可以提示 重要的染色體重排及正在進(jìn)行的癌癥發(fā)展。

因此在癌癥診斷范圍，在科研和臨床應(yīng)用中，通過核酸特異性染色對細(xì) 胞核DNA進(jìn)行量化正在越來越多地進(jìn)入實(shí)際應(yīng)用中。

通過流式或成像細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞核DNA含量進(jìn)行測量特別基于如下假 設(shè)：(i)結(jié)合至DNA的染料的量正比于存在的DNA的量，和(ii)從染料通 過發(fā)射、吸收或透射產(chǎn)生的光信號正比于染料的量。

典型地用于通過DNA成像細(xì)胞術(shù)(DNA?image?cytometry)測量細(xì)胞核 DNA的一種DNA特異性染色方法是一種基于酸的反應(yīng)，根據(jù)Feulgen和 Rossenbeck命名，通常簡單地稱為福爾根反應(yīng)(Feulgen?reaction)。事實(shí)上所 述福爾根反應(yīng)是一種生色反應(yīng)，其中DNA被酸水解產(chǎn)生具有游離醛基的不 含嘌呤的DNA(即所謂脫嘌呤核酸(apurinic?acid，APA))。這些物質(zhì)之后與含 有共價(jià)結(jié)合至所述游離醛基的染料的希夫試劑(schiffs?reagent)反應(yīng)。

雖然所述福爾根反應(yīng)對于DNA具有特異性，但是其具有多種缺點(diǎn)。其 非常耗費(fèi)時(shí)間，并且是一種復(fù)雜精細(xì)的反應(yīng)，需要非常小心地控制并驗(yàn)證以 獲得可重復(fù)的和有意義的結(jié)果。普遍用于移除嘌呤堿基的HCl將APA水解 為較小片段導(dǎo)致一個(gè)問題。APA分子的片段化導(dǎo)致這些片段從細(xì)胞核中移 除并因此導(dǎo)致丟失可染色的DNA物質(zhì)。

因此，本領(lǐng)域中已經(jīng)進(jìn)行了嘗試以基于形態(tài)特征鑒定、免疫組化染色和 DNA染色的組合可靠地檢測癌細(xì)胞并診斷癌癥。

US?2004/0197839?A1公開了同時(shí)使用兩種不同類型的染色以鑒別癌細(xì) 胞，其中一種染色例如檢測形態(tài)特征，而第二種(免疫學(xué))染色例如測量一種 腫瘤特異性標(biāo)記的表達(dá)。

但是，仍然需要給出測量細(xì)胞核DNA的量并檢測癌細(xì)胞和癌癥的可靠、 迅速及有效的途徑的方法。

發(fā)明目的和簡述

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于確定細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)的核酸的量的方法。 這些核酸可以是雙鏈的，例如DNA。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供檢測待測生物樣品中癌細(xì)胞的存在的方法。

本發(fā)明一個(gè)進(jìn)一步的目的是提供使得能夠診斷人或動物對象體內(nèi)癌癥 的存在和/或癌癥可能發(fā)生的方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，提供了獨(dú)立權(quán)利要求中限定的方法。本發(fā)明一些優(yōu) 選的實(shí)施方案特別在從屬權(quán)利要求中限定。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，提供了體外確定至少一個(gè)生物樣品中存在 的至少一個(gè)細(xì)胞中的細(xì)胞核核酸例如細(xì)胞核DNA的量的方法，其中所述方 法包括如下步驟：

a)體外確定所述細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核的位置和/或尺寸，

b)體外確定a)中確定的細(xì)胞核的邊界內(nèi)的UV吸收。

在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，所述細(xì)胞核的位置和/或尺寸可以通過使用 UV光和/或相差顯微術(shù)在所述至少一個(gè)細(xì)胞中(粗略)確定。如果在步驟a)中 使用UV光，應(yīng)當(dāng)優(yōu)選地使用波長在大約240nm和大約280nm之間的UV 光。特別優(yōu)選的是波長例如為大約250nm、255nm或260nm。