[發明專利]用于在微流體裝置中檢測分離的mRNA的緩沖液

無效

• 申請號: 200780007477.0
• 申請日: 2007-02-21
• 公開（公告）號: CN101395169A
• 公開（公告）日: 2009-03-25
• 發明（設計）人: L·尤戈佐利
• 申請（專利權）人: BIO－RAD實驗室公司
• 主分類號: C07H21/00
• 分類號: C07H21/00
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所
• 代理人: 羅菊華

相關申請的交叉引用

該申請要求提交于2006年3月2日的美國臨時申請No. 60/779,312的權利，該申請作為參考引入此處。

發明背景

目前已有用于從細胞裂解物中制備mRNA的緩沖液會裂解細胞核， 并且是高電導率的(參見，例如，美國專利公開2005/0053952)。高 電導率使目前的緩沖液不適用于微流體裝置中或結合使用流體和電動 流動的微流體操作中，包括選擇性離子提取(SIE)。此外，細胞核的 破裂會導致在細胞裂解物中污染基因組DNA。

本發明通過提供電導率足夠低的、適用于微流體操作并且不破壞 細胞核的完整性的緩沖液解決了這些缺點。

發明概述

本發明提供了使用低電導率的緩沖液制備能直接用作mRNA檢測 模板的、沒有基因組DNA污染的細胞裂解物的方法和試劑盒。

相應的，在第一個方面，本發明提供了在細胞中檢測mRNA方法。 在一些實施方案中，該方法包括：

a)使細胞和緩沖液接觸，由此生成包含完整細胞核的細胞裂解物， 其中所述緩沖液具有10mS/cm或更低的電導率；

b)從裂解物中分離細胞核，由此產生含有mRNA的上清；

c)通過微流體分離，使上清中的mRNA從逆轉錄酶抑制劑和DNA 聚合酶抑制劑中分離出來；和

d)用逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)擴增至少一個mRNA序列， 由此檢測細胞中的mRNA。

在一些實施方案中，微流體分離包括選擇性離子提取(SIE)。

在一些實施方案中，通過離心實行從裂解物中分離細胞核的步驟。

在實行本方法中，優選的，基因組DNA(gDNA)是不可擴增檢出的。

在另一個方面，發明提供的試劑盒包含：

i)包含微流體通道的底板；和

ii)ii)具有10mS/cm或更低電導率的緩沖液。

在一些實施方案中，所述底板適用于選擇性離子提取(SIE)。

對于方法和試劑盒的實施方案，所述緩沖液可以具有大約9、8、 7、6、5、4、3、2、1mS/cm或者大約0.5-10mS/cm之間的任意值的 電導率。在一些實施方案中，所述緩沖液具有5mS/cm或更低的電導 率。在一些實施方案中，所述緩沖液具有2mS/cm或更低的電導率。

在一些實施方案中，所述緩沖液包含具有如下濃度的下述組分： 至多50mM的氯化鈉，例如，10、20、30、40、50mM，或者5-20mM?NaCl； 至多50mM的生物學緩沖試劑，pH?6.0-8.3，例如10、20、30、40、 50mM，或者5-20mM生物學緩沖試劑，pH為例如6.0、6.5、6.8、7.0、 7.2、7.4、7.5、7.7、8.0、8.3；至多15mM的氯化鎂，例如大約1-5 mM、3、5、7、10、12、15mM?MgCl₂；至多5.0％(v/v)的非離子型 去污劑，例如，0.2-5.0％、0.5-2.0％，0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、 2.5、3.0、4.0、5.0％的非離子型去污劑。

所述緩沖液可以進一步包含RNA酶抑制劑。在一些實施方案中， 非離子型去污劑選自NP-40、Triton-Xn(n＝100-500)、聚氧乙烯 嵌段共聚物(polyoxyalkylene?block?copolymer)、聚乙二醇脂肪 酸酯、甘油酯。其它的非離子型表面活性劑列于(例如)美國專利 6,383,471中，此處被引用作為參照。在一些實施方案中，生物學緩 沖試劑選自于檸檬酸鹽、磷酸鹽、ACES、BES、EPPS、甘氨酸、組氨酸、 HEPES、BIS-TRIS、TRIS和MES。其它的生物學緩沖試劑可購于，例如， Sigma-Aldrich，St.Louis，MO。

在一個實施方案中，所述緩沖液包含如下濃度的如下組分、基本 上由如下濃度的如下組分組成或者由如下濃度的如下組分組成：

10mM氯化鈉；

10mM?TRIS，pH?7.4；

3mM氯化鎂；

0.5％(v/v)NP-40；以及

任選地，RNA酶抑制劑。

附圖簡要說明