[發明專利]檢測類/抗維甲酸化合物的雙雜交酵母以及生物測試方法

有效

• 申請號: 200710308511.X
• 申請日: 2007-12-29
• 公開（公告）號: CN101469316A
• 公開（公告）日: 2009-07-01
• 發明（設計）人: 王子健;李劍;馬梅;饒凱鋒
• 申請（專利權）人: 中國科學院生態環境研究中心
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/12;C12N15/81;C12Q1/06;C12R1/865
• 代理公司: 北京泛華偉業知識產權代理有限公司
• 代理人: 郭廣迅;曹津燕

1.一種用于檢測樣品中類/抗維甲酸化合物和/或天然維甲酸化合物的雙雜交酵母，其特征在于，該酵母中含有pGBT9-RXR酵母表達質粒和pGAD424-GRIP1酵母表達質粒，并且所述pGBT9-RXR酵母表達質粒包含維甲酸X的受體基因，pGAD424-GRIP1酵母表達質粒包含序列為SEQ?ID?No.2的維甲酸X受體共激活因子基因片段，所用酵母為釀酒酵母Y187。

2.根據權利要求1所述的雙雜交酵母，其特征在于，所述維甲酸X受體基因為鼠維甲酸X受體基因或序列為SEQ?ID?No.1的鼠維甲酸X受體基因片段。

3.根據權利要求1或2所述的雙雜交酵母，其特征在于，該雙雜交酵母是釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)RXR-GRIP1，其保藏編號為：CGMCC?No.2305。

4.根據權利要求1或2所述的雙雜交酵母，其特征在于，所述類維甲酸化合物選自有機錫類類維甲酸化合物、酚類類維甲酸化合物、鄰苯二甲酸酯類類維甲酸化合物和有機氯農藥類類維甲酸化合物中的一種或幾種，并且所述的抗維甲酸化合物選自酚類抗維甲酸化合物、鄰苯二甲酸酯類抗維甲酸化合物和有機氯農藥類抗維甲酸化合物中的一種或幾種。

5.一種制備權利要求1-4中任一項所述的雙雜交酵母的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

(1)純化包含維甲酸X受體基因的pGBT9-RXR酵母表達質粒；

(2)純化包含維甲酸X受體共激活因子基因的pGAD424-GRIP1酵母表達質粒；

(3)構建雙雜交酵母，用所述的pGBT9-RXR質粒和所述的pGAD424-GRIP1質粒轉化進入酵母細胞中，形成雙雜交酵母。

6.根據權利要5所述的方法，其特征在于所述的形成雙雜交酵母之后還篩選所述的雙雜交酵母。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述的篩選雙雜交酵母是采用營養缺陷型篩選和菌落轉移濾膜分析相結合的方法篩選雙雜交酵母。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述的菌落轉移濾膜分析是采用添加維甲酸的X-gal緩沖液的菌落轉移濾膜分析。

9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述維甲酸為9-順維甲酸。

10.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述X-gal緩沖液為20mg·mL^-1的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷的二甲基甲酰胺溶液。

11.根據權利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述營養缺陷型篩選中采用的培養基為不添加亮氨酸和色氨酸的SD培養基，該培養基由20mg/L腺嘌呤半硫酸鹽、20mg/L鹽酸精氨酸、20mg/L一水合鹽酸組氨酸、30mg/L異亮氨酸、30mg/L鹽酸賴氨酸、20mg/L甲硫氨酸、50mg/L苯丙氨酸、200mg/L蘇氨酸、30mg/L酪氨酸、20mg/L尿嘧啶、150mg/L纈氨酸和6.7g/L無氨基酸酵母氮源組成。

12.權利要求1-4中任一項所述的雙雜交酵母用于檢測類維甲酸化合物的生物測試方法，該方法包括如下步驟：

(1)首先將雙雜交酵母細胞分別接種于已知系列濃度維甲酸培養液，形成菌液，培養2-4小時；

(2)培養結束后，向菌液中加入鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反應液進行反應30-60分鐘，檢測上清液在420nm處的吸光度值，并以此作為表示β-半乳糖苷酶活性的參數；

(3)根據所述的系列濃度維甲酸相對于它所對應的β-半乳糖苷酶活性的參數繪制β-半乳糖苷酶活性的誘導劑量-效應關系標準曲線；

(4)將所述雙雜交酵母細胞與待測樣品共培養，加入鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反應液進行反應，終止反應后檢測反應上清液在420nm處的吸光度值，對照所述的β-半乳糖苷酶活性的誘導劑量-效應關系標準曲線計算出待測樣品中類維甲酸化合物的含量。

13.根據權利要求12所述的生物測試方法，其特征在于，所述的待測樣品為環境樣品的有機溶劑提取液，其中的類維甲酸濃度為10^-9～10^-7mol/L。