[發明專利]豬疫苗使用的pIL-12基因佐劑及制備方法

無效

• 申請號: 200710306038.1
• 申請日: 2007-12-29
• 公開（公告）號: CN101468202A
• 公開（公告）日: 2009-07-01
• 發明（設計）人: 邵峰;溫建新
• 申請（專利權）人: 邵峰;溫建新
• 主分類號: A61K39/39
• 分類號: A61K39/39;C12N15/24;A61P37/02;A61P29/00
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技術領域

本發明涉及一種白介素-12的應用，具體涉及一種豬疫苗使用的pIL-12基因佐劑及制備方法。

背景技術

迄今為止，許多傳染性疾病尚未得到有效防治，現行的滅活疫苗或弱毒疫苗等傳統疫苗或免疫效力低下，或存在安全性問題，促使人們開發安全有效的新型疫苗?；谥亟MDNA技術的基因工程疫苗安全可靠、易于鑒別診斷，具有很大的應用前景，但其抗原性一般較弱，需要有效的免疫佐劑以增強其保護效力。

發明內容

本發明的目的在于針對pIL-12在豬各種疾病中的免疫調節作用，以及開發治療免疫功能紊亂的免疫調節劑及某些炎性疾病的抗炎防治劑，提供了一種豬疫苗使用的pIL-12基因佐劑及制備方法。

本發明的技術方案為：一種豬疫苗使用的pIL-12基因佐劑，pIL-12包括兩個亞基的編碼基因p35和p40，p35編碼基因大小為720bp，p40為1044bp，分別編碼223個氨基酸和325個氨基酸的多肽。

一種豬疫苗使用的pIL-12基因佐劑的制備方法，從LPS活化的豬外周血單個核細胞(PBMC)提取總RNA，用RT-PCR方法擴增出pIL-12兩個亞基的編碼基因p35和p40，然后將p35基因和p40基因分別亞克隆到原核表達載體pET30c、pET30b中，克隆pIL-12基因。

優選的是，所述的RNA的提取過程為：從豬前腔靜脈采血，然后用淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞(PBMC)，用RPMI1640培養基進行培養，并加LPS于細胞培養液，分別取誘導2小時和12小時的細胞，用Trizol試劑盒提取總RNA。

優選的是，所述的RPMI1640培養基含有10U/ml青霉素、10U/ml鏈霉素和10％胎牛血清。

優選的是，所述的RT-PCR方法為：分別取誘導2小時和12小時的細胞所提取的總RNA，加入適量下游引物P2、P4，然后分別加入dNTP、10×buffer、RNasin、AMV反轉錄酶，再加入適量的Ex.Taq?DNA聚合酶進行PCR擴增，組成2個反轉錄擴增體系，合成p35和p40的PCR產物p35?cDNA和p40?cDNA。擴增結束后取5μL混合物，利用2％瓊脂糖凝膠進行電泳。將p35和p40的PCR產物分別用BamHI和EcoRI酶切鑒定。

優選的是，所述的擴增體系包括p35擴增體系和p40擴增體系，p35擴增體系的反應條件為：預加熱95℃?5min，然后94℃?1min，54℃?1min，72℃?1min，30個循環，最后72℃延伸10min；p40擴增體系及反應條件與p35相似，不同之處是退火溫度為56℃。

優選的是，所述的克隆pIL-12基因的過程為：取SacI和SalI酶切處理的原核表達載體pET30c、pET30b和p35或p40的PCR產物，分別加入T₄?DNA連接酶和10×buffer，組成兩個連接反應體系，16℃進行12小時連接反應，連接產物轉化E.coli?JM109感受態細胞，挑取陽性菌落，提取質粒。

優選的是，所述的克隆的鑒定為：將提取的質粒用PCR和SacI、SalI雙酶切進行鑒定并篩選陽性克隆。

本發明的有益效果為：白細胞介素-12(IL-12)又名NK細胞刺激因子(NKSF)或細胞毒淋巴細胞成熟因子(CLMF)，能誘導T細胞和NK細胞產生IFN-γ，并增強其細胞毒活性，它的關鍵作用是能誘導Th0細胞分化為Th1細胞以激發細胞免疫進程。IL-12是啟動保護性細胞免疫的有效佐劑，在調節機體非特異性和特異性免疫方面具有重要作用，其調節方式主要通過刺激NK細胞和細胞毒淋巴細胞來完成。IL-12能調節免疫反應的方向，這為細胞因子佐劑應用于滅活疫苗提供了理論基礎。按預期反應類型來調節保護性免疫，即調控疫苗誘導的免疫反應，使之朝細胞免疫為主的方向發展而不是體液免疫為主的方向發展，這在開發以細胞免疫為主的感染性疾病的有效疫苗方面很有意義。

附圖說明

圖1為本發明具體實施例p35/pET30c的構建示意圖；

圖2為本發明具體實施例p40/pET30b的構建示意圖；

圖3為本發明具體實施例P35亞基的基因序列及預測蛋白的氨基酸序列圖；

圖4為本發明具體實施例P40亞基的基因序列及預測蛋白的氨基酸序列圖。

具體實施方式