[發明專利]一種含有糖鏈的白蛋白、其制備方法及其用途

無效

• 申請號: 200710305111.3
• 申請日: 2007-11-06
• 公開（公告）號: CN101429240A
• 公開（公告）日: 2009-05-13
• 發明（設計）人: 中城圭介;片山直久;甲斐俊哉;小田切優樹
• 申請（專利權）人: 尼普洛株式會社
• 主分類號: C07K14/76
• 分類號: C07K14/76;C12N15/14;C12N15/81;A61K47/42
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司
• 代理人: 郭文潔;李平英

技術領域

本發明涉及一種在特定的氨基酸殘基上選擇性添加了糖鏈的新型含糖鏈的白蛋白蛋白質，其制備方法及其用途。更具體地，本發明涉及包含可通過宿主細胞進行糖鏈修飾的部分氨基酸的變異型白蛋白的該部分氨基酸上選擇性地附加了糖鏈的、含糖鏈的白蛋白。編碼該變異型白蛋白的DNA，通過培養含有該DNA的真核細胞制備該含糖鏈的白蛋白蛋白質的方法，及該蛋白質作為藥物載體的用途。

背景技術

人血清白蛋白(以下稱為“HSA”)廣泛分布于體內血液及細胞間液中。其一級結構是由585個氨基酸組成的，不具有糖鏈結構，且分子量大約為66.5kDa的單純蛋白質。該蛋白質在肝臟中的作用主要是負責維持血流中的正常滲透壓、及維持血液中的液體含量。因此，在多種臨床狀況下，例如外科手術、休克、燒傷、浮腫引起的低蛋白血癥等，存在血管液體損失的狀態中，常用HSA進行治療。

此外，HSA起到了作為多種血清分子載體的機能，由于安全性、生物適應性、生物分解性、血中滯留性強，因此在動態特性方面存在問題的藥物給藥系統(DDS)中可以作為優選載體。

目前存在通過HSA與藥物不可逆結合的DDS，利用HSA的較長半衰期來提高結合的藥物在血中滯留性的方法、以及使用HSA修飾體作為主動輸送系統的載體的方法等。在前者中，已經嘗試通過基因融合技術使半衰期較短的蛋白質及生理活性肽等作為雜合體表達。另一方面，在后者中，嘗試深入研究了陰離子化、陽離子化等調節HSA的物理化學性質的方法，以及通過導入糖結構、肽等存在于細胞表面的受體的識別元件(裝置)，實現精密的動態控制及細胞特異性靶定(非專利文獻1至6)。

在肝臟中已知存在識別糖殘基及負電荷等的受體。利用這種性質，與琥珀酸及半乳糖、甘露糖等結合的白蛋白可用于對肝臟靶向。

然而，在對HSA進行化學修飾時，了解到其具有

(1)除非結合了非常多的糖殘基，否則無法識別肝臟；

半乳糖修飾的白蛋白除非在每個白蛋白分子上結合10個以上的半乳糖，否則無法識別肝臟(參見非專利文獻5)。

(2)對肝臟非實質細胞群的細胞特異性較低：

甘露糖及巖藻糖修飾的白蛋白已知可被肝內皮細胞及肝巨噬細胞兩種細胞吸收(參見非專利文獻6)。

(3)很難制備均一的結合體，必須找到適當的結合條件；

等等的問題。因此，強烈希望開發出一種使用非化學手段修飾HSA的方法。

非專利文獻1：Lee?YC等人，Biochemisty?15：3956-3963，1976

非專利文獻2：Opanasopit?P等人，Am.J.Physiol.Gastrointest.Liver?Physiol.280：879-889，2001

非專利文獻3：Takakura?Y等人，Int.J.Pharm.105：19-29，1994

非專利文獻4：Yamasaki?Y等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.301：467-477，2002

非專利文獻5：Nishikawa?M等人，Am.J.Physiol.Gastrointest.Liver?Physiol.268：G849-G856，1995

非專利文獻6：Higuchi?Y等人，Int.J.Pharm.287：147-154，2004

本發明的目的是提供一種可在肝臟、尤其是肝巨噬細胞中特異性移動的、均一的含糖鏈的白蛋白，更具體是提供血清白蛋白，還提供一種適用于遞送至肝臟的DDS的藥物載體。

本發明人為了達成上述目的，進行銳意研究，得到以下結果：利用定點誘變法，將N結合型糖鏈的共有序列(Asn-X-Thr/Ser)導入編碼HSA的DNA中，通過培養經含有編碼所獲得的變異型HSA的DNA的表達載體轉化的巴斯德畢赤酵母(Pichia?pastoris)，成功制備了肝臟轉移性較高的、在該共有序列的Asn殘基上添加添加了高甘露糖型糖鏈的含糖鏈的HSA，由此完成了本發明。

發明內容

即，本發明提供了：

(1)包含可通過宿主細胞進行糖鏈修飾的部分氨基酸的變異型白蛋白的該部分氨基酸上選擇性地附加了糖鏈的、含糖鏈的白蛋白；

(2)上述(1)所述的蛋白質，其中糖鏈是高甘露糖型糖鏈；

(3)上述(1)或(2)所述的蛋白質，其中該部分氨基酸序列至少一個是Asn-Xaa-Thr或Asn-Xaa-Ser(Xaa是涉及遺傳編碼的任意氨基酸)；