[發明專利]一種鑒定微生物肥料中沼澤紅假單胞菌的方法

無效

• 申請號: 200710304326.3
• 申請日: 2007-12-27
• 公開（公告）號: CN101195841A
• 公開（公告）日: 2008-06-11
• 發明（設計）人: 關大偉;李俊;沈德龍;姜昕;曹鳳明;李力;陳慧君
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C12Q1/68;C07H21/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

所屬技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體而言，涉及利用適當的引物通過PCR反應，檢測微生物肥料中沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris(Molish)van?Niel)的方法，以及在該方法中所用的引物。

技術背景

光合細菌(Photosynthetic?Bacteria，簡稱PSB)是地球上最早出現的一大類能以光作為能源，以CO2和有機物作為光合作用碳源，以有機物、氫氣或硫化物為供氫體而營養繁殖的原核生物的總稱。它廣泛分布在海洋、河川、沼澤、水溝、活性污泥、土壤、極地、溫泉和高鹽水體等各種生境中。光合細菌因具有復雜多樣的代謝功能、豐富的營養及生理活性物質等特性，使之在種植業、養殖業以及環境廢水處理等方面得到了廣泛應用。以光合細菌為菌種生產的微生物肥料產品在水稻、蔬菜、果樹和煙草等作物上都取得了較好效果，研究表明光合細菌具有改善土壤的結構和營養狀況、提高土壤肥力、增強作物抗病防病能力、提高作物的光合作用能力、提高作物品質等等方面功效。

鑒于光合細菌多功能性，人們希望將其應用于微生物肥料以提高肥效。為確保含光合細菌的微生物肥料產品的使用效果，需要明確肥料產品中的光合細菌的種類和質量。因而需要一種使用簡便，結果準確的質量檢測技術應用于產品質量監督環節。目前使用的傳統光合細菌菌種鑒定是以形態特征和各項生理生化方法為主，操作步驟煩瑣，檢測時間較長，并且特異性差。因此，迫切需要研究建立快速、準確、靈敏的光合細菌檢測新方法，以滿足光合細菌產品的質量檢測的準確性和時效性。

PCR方法有著快速、準確和靈敏的特點，已經在醫學和衛生檢測方面得到了廣泛的應用，有報道稱目前已對多種病毒和病源菌，例如乙肝病毒、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等建立了基于PCR技術的檢測方法。為將PCR技術應用于微生物肥料檢測領域，本發明人通過反復摸索實踐建立了一種基于PCR技術的、快速、準確、靈敏地檢測微生物肥料生產中常用的光合細菌的方法。該方法特別適用于沼澤紅假單胞菌的鑒定。本發明是通過下述的技術方案實現的。

發明內容

本發明的目的在于提供一種應用特異引物PCR技術對微生物肥料中常見的光合細菌進行鑒定的方法。在本發明的一個優選的實施方案中提供了通過特異引物PCR技術鑒定沼澤紅假單胞菌和其產品菌種的鑒定方法。在進一步優選的實施方案中，所述的沼澤紅假單胞菌純菌種。本發明的另一目的在于提供上述鑒定方法中所用的特異引物。

具體而言，本發明基于已知的沼澤紅假單胞菌16S?rDNA核酸序列，設計了上述菌種的特異引物。通過優化PCR反應中的鎂離子濃度和退火溫度等條件來提高PCR方法的特異性，并根據優化結果建立了沼澤紅假單胞菌的PCR鑒定方法，用于檢測微生物肥料中光合細菌產品的沼澤紅假單胞菌。

本專利發明的鑒定沼澤紅假單胞菌的PCR方法為：

上游引物1：5’-GCGGGAAGATAATGACGGT；

下游引物2：5’TGGTAGCAACTAAGGACGG.

PCR反應體系1：10×buffer????2μL

dNTPs(10mmol/L)?????????????1.6μL

引物1(10μmol/L)????????????0.5μL

引物2(10μmol/L)????????????0.5μL

Taq?E(2.5U/μL)?????????????0.2μL

模板DNA?????????????????????2.0μL

鎂離子(25mmol/L)????????????0.8μL

補足ddH₂O???????????????????20μL

PCR擴增參數1：95℃????5min

72℃??????????????????30s

72℃??????????????????10min

附圖說明

圖1為應用沼澤紅假單胞菌特異引物對標準菌株進行PCR的實驗結果(照片)如所示。其中，各泳道的具體說明如下：

泳道1：多粘類芽孢桿菌(Paenibacillu?polymyxa)

泳道2：短短芽孢桿菌(Brevibacillus?brevis)

泳道3：枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)

泳道4：蘇云金芽孢桿菌(Bacillus?thuringiensis)