[發(fā)明專利]一種仙人掌類植物DNA的提取和純化方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710202964.4
• 申請日: 2007-12-10
• 公開（公告）號: CN101182344A
• 公開（公告）日: 2008-05-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔡永強(qiáng);陶剛;向青云;劉濤;金吉芬;韋茜
• 申請（專利權(quán)）人: 貴州省果樹科學(xué)研究所
• 主分類號: C07H21/04
• 分類號: C07H21/04;C07H1/08
• 代理公司: 貴陽中新專利商標(biāo)事務(wù)所
• 代理人: 郭防

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種DNA的提取和純化方法，特別是涉及提取DNA時會產(chǎn)生粘液的仙人掌類植物DNA的提取和純化方法。

背景技術(shù)

仙人掌主要分布于美洲熱帶地區(qū)，目前世界上已知的有2000種以上，其中以墨西哥最多，我國的西南和華南沿海地區(qū)也有少數(shù)野生的仙人掌植物。近十幾年來通過引種栽培，仙人掌植物在我國已逐年增多。主要分布在我國南部。由于食用和果用仙人掌類植物的市場需求不斷增加，為了更好的利用和保護(hù)這些資源，大量的研究工作正在展開，這些研究工作包括揭示其種間親緣關(guān)系、遺傳多樣性以及分子標(biāo)記育種等，進(jìn)行這些研究的前提是得到純度較高的DNA。但是，仙人掌類植物中含有粘液物質(zhì)，采用標(biāo)準(zhǔn)的CTAB方法提取DNA會受到粘液物質(zhì)的干擾，得不到很純的DNA，不能滿足研究的需要。如何從含有粘液物質(zhì)的仙人掌類植物中提取純度較高的DNA是分子生物學(xué)研究人員急待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：提供一種能有效的從含有粘液的仙人掌類植物中提取和純化DNA的方法，該方法可以有效的克服粘液物質(zhì)的干擾，提取的DNA的純度可以達(dá)到進(jìn)一步研究的需要。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的提取和純化方法為：將經(jīng)過預(yù)處理的試樣于液氮中磨成粉末，加入65℃的細(xì)胞裂解液后置65℃水浴中保持，然后離心，吸取上清液，加入4℃飽和酚溶液和常溫氯仿，離心，吸取上清液，加入4℃乙酸鉀溶液和-20℃異丙醇，置于-20℃的冰柜中進(jìn)行沉淀，吸取團(tuán)狀DNA沉淀用70％乙醇洗滌并風(fēng)干，然后沉淀用4℃TE緩沖液充分溶解，溶解后加入4℃飽和酚和常溫氯仿，重復(fù)從第二次離心至風(fēng)干沉淀的操作一次，所得沉淀用4℃TE緩沖液溶解即得DNA的TE溶液。

具體的操作步驟如下：

(1)取5～8g經(jīng)過預(yù)處理的試樣于液氮中迅速研磨成粉末，然后快速轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中；

(2)立即加入65℃預(yù)熱的細(xì)胞裂解液600μl，置于65℃水浴中保溫50～70分鐘，其間每隔5～10min輕搖1次，將裂解樣離心18～22分鐘，吸取上清液于離心管中；

(3)在步驟(2)的離心管中加入上清液同體積的4℃飽和酚溶液和常溫氯仿，輕搖8～12分鐘，以12000r/min離心18～22分鐘；

(4)吸取上清液于1.5ml離心管中，加入上清液體積0.1倍的4℃乙酸鉀溶液和上清液同體積的-20℃異丙醇，放置于20℃的冰柜中18～22分鐘；

(5)吸取離心管中的團(tuán)狀DNA沉淀于1.5ml離心管中，用70％乙醇洗滌沉淀2次，風(fēng)干沉淀；

(6)沉淀用4℃TE緩沖液溶解，在4℃保存2小時使DNA充分溶解；

(7)重復(fù)(3)～(5)的操作一次，沉淀加4℃TE緩沖液300μl溶解，保存于4℃的冰箱備用。

優(yōu)選地，仙人掌類植物DNA的提取和純化方法如下：

(1)取5～8g經(jīng)過預(yù)處理的試樣于液氮中迅速研磨成粉末，然后快速轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中；

(2)立即加入65℃預(yù)熱的細(xì)胞裂解液600μl，置于65℃水浴中保溫1小時，其間每隔5～10min輕搖1次，將裂解樣離心20分鐘，吸取上清液于離心管中；

(3)在步驟(2)的離心管中加入上清液同體積的4℃飽和酚溶液和常溫氯仿，輕搖10分鐘，以12000r/min離心20分鐘；

(4)吸取上清液于1.5ml離心管中，加入上清液體積0.1倍的4℃乙酸鉀溶液和上清液同體積的-20℃異丙醇，放置于-20℃的冰柜中20分鐘；

(5)吸取離心管中的團(tuán)狀DNA沉淀于1.5ml離心管中，用70％乙醇洗滌沉淀2次，風(fēng)干沉淀；

(6)沉淀用4℃TE緩沖液溶解，在4℃保存2小時使DNA充分溶解；

(7)重復(fù)(3)～(5)的操作一次，沉淀加4℃TE緩沖液300μl溶解，保存于4℃的冰箱備用。

其中，前述細(xì)胞裂解液為2％CTAB細(xì)胞裂解液，其配制方法為：在去離子水中加入CTAB4g、NaCl?16.364g和1mol/l的Tris-HCl?20ml，充分溶解，定容至200ml。

所述飽和酚的pH值為8.5。

所述乙酸鉀溶液是濃度為3mol/l、pH值為5.2的乙酸鉀水溶液。