[發(fā)明專利]一種快速定量線蟲死亡率的新方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710202068.8
• 申請日: 2007-10-16
• 公開（公告）號: CN101149366A
• 公開（公告）日: 2008-03-26
• 發(fā)明（設計）人: 李紅玉;丁曉霞;支德娟
• 申請（專利權）人: 李紅玉;蘭州大學
• 主分類號: G01N33/00
• 分類號: G01N33/00;C12Q1/18
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發(fā)明涉及一種快速定量線蟲死亡率的新方法，以及這種方法在藥物篩選、農藥篩選、環(huán)境評價、水質評價等方面的應用，屬于模式生物的應用領域。

背景技術

秀麗隱桿線蟲(C.elegans)是一種生長在土壤中的線蟲，以細菌為食，很容易在實驗室培養(yǎng)。成蟲體長1mm，且通體透明，在顯微鏡下易于觀察。L₃～L₄期對外界敏感。從一個受精卵發(fā)育成可以產卵的成蟲，它只需要3天。在自然狀態(tài)下，秀麗隱桿線蟲絕大部分個體為雌雄同體，其一生能產生約300個受精卵，如果在一個培養(yǎng)皿上放上幾只線蟲，幾天之后就可得到大量的后代^[1]。上述這些特點使得秀麗隱桿線蟲在很多方面都有應用^[2]。

廈門大學柯翎等人^[3]以秀麗隱桿線蟲作為重金屬污染的指示生物，研究了Cu²⁺，Cd²⁺，Pb²⁺，Zn²⁺等4種重金屬離子對秀麗隱桿線蟲的毒性，發(fā)現重金屬離子濃度越高，毒性越強，線蟲死亡率越高。在高濃度組中線蟲的中毒反應較迅速，短期內就出現死亡；而在低濃度組，中毒反應較緩慢，經較長時間才出現死亡，對照組相對其他各組，存活時間最長。北京師范大學的鄢雯等人^[4]將秀麗隱桿線蟲用于環(huán)境水質的監(jiān)測，同樣發(fā)現秀麗隱桿線蟲存活率與水樣毒性之間存在緊密的關系，水樣毒性越大，線蟲死亡率越高，因此可用秀麗隱桿線蟲的存活率評價飲用水源水和水廠工藝水水樣毒性。王曉等人^[5]也將秀麗隱桿線蟲用于對造紙廠廢水中酸堿類毒物的追蹤。實驗顯示，用秀麗隱桿線蟲指示重金屬危害、水樣毒性大小等既降低了實驗成本，又提高了檢測效率，所以利用其作為環(huán)境評價、水質評價的指示生物具有可觀的應用前景。

萬樹青等人^[6]用秀麗隱桿線蟲的死亡率來評價棉酚，克線磷，甲基異柳磷，氧樂果，滅多威，硫酸銅等多種農藥的殺蟲效果，取得了理想的效果。實驗顯示：棉酚對秀麗隱桿線蟲的擊倒率強于其他幾種殺線劑，克線磷次之，其它幾種農藥對秀麗隱桿線蟲的擊倒率都從實驗結果上可以清楚的看到。這個結果與運用蠶蛾作為實驗對象的研究結果是一致的^[7]。國外將秀麗隱桿線蟲用于體內驅蟲藥物藥效篩選的研究已有相關的文章發(fā)表^[8]，為驅蟲藥的體外研究提供了可行方法，并且呈現良好的選擇性、準確度及重復性，而且成本低廉。這些研究表明，線蟲死亡率的大小反應了的供試物的藥效和毒性的大小，因此，線蟲死活的判斷就成為這類研究的重要實驗指標。

判斷線蟲死活的傳統(tǒng)方法是體態(tài)法。即死的線蟲多呈僵直狀態(tài)，而活的體態(tài)彎曲，一般盤卷或蠕動。但是這種方法對呈不活躍和麻痹狀態(tài)的線蟲是不適用的，此時只能用鉑絲來觸拔線蟲以引起線蟲運動來鑒別其死活，因此這種方法費時、費力，工作量極大。為了改變這種狀況，萬樹青等人^[6]試圖通過染色方法來區(qū)分死活線蟲從而測定被測物殺線劑的活性，他們比較了中性紅，甲基藍，番紅花紅，曙紅等4種染料的染色效果，發(fā)現這4種染料都能使死亡線蟲著色，而活線蟲不著色，番紅花紅效果最好。但是這種方法仍然需要在顯微鏡下一一計數，工作量依然很大。

美國專利(專利號為20060191023)公開了一種應用熒光染色劑法來鑒別死活線蟲的染色方法。這種方法已用于驅蟲藥物的篩選研究，由于染色后活的線蟲無熒光，而死亡的線蟲有熒光，利用測試熒光強度的大小來確定線蟲的死亡率，這樣為高通量篩選提供了保證，但此法對設備要求依然較高，難以在普通實驗室得以推廣和應用。

由于線蟲自身有重量，在水溶液中很快下沉，所以上面所提的熒光高通量篩選方法存在另一個限制點：即多孔板中每一個孔中供試線蟲的數量難以掌握。美國專利(專利號20030154501)用一定濃度的PEG8000、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、甘油溶液，可使線蟲均勻分布于溶液中，以保證線蟲均勻加入多孔板，使供試線蟲數量可控。但是上述藥品價格偏高且對線蟲具有一定的毒性。

鑒于現有技術存在的缺陷，本發(fā)明提供了一種簡單易行、成本低廉的快速定量線蟲死亡率的新方法，可以方便地應用于新藥篩選、農藥篩選、環(huán)境評價水質評價等方面。

參考文獻：

1.龐林海等，秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)與保存方法，浙江農業(yè)學報，2007，19(1)：34～36.