[發明專利]缺氧誘導真核基因表達載體及其用途

無效

• 申請號: 200710195767.4
• 申請日: 2007-12-14
• 公開（公告）號: CN101532027A
• 公開（公告）日: 2009-09-16
• 發明（設計）人: 鄭少鵬;殷愛紅;武文琦
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學
• 主分類號: C12N15/79
• 分類號: C12N15/79;A61K48/00;A61P9/10;A61P35/00
• 代理公司: 北京天昊聯合知識產權代理有限公司
• 代理人: 羅會英;劉榜美

技術領域

本發明涉及基因工程，特別涉及一種缺氧誘導真核基因表達載體及其用途。

背景技術

缺氧可引起一系列的生理反應，如誘導與紅細胞生成和血管生成相關基因的表達；同時缺氧與許多疾病的發生也存在著密切的關系，如糖尿病性視網膜病、中風、關節炎、缺血性心臟病等。機體對缺氧能夠產生反應是由于在哺乳動物體內廣泛存在著缺氧誘導因子(hypoxia?induciblefactor-1，HIF-1)，缺氧情況下HIF-1生成增加，可作用于靶基因的缺氧反應元件(hypoxia?responsive?element，HRE)，啟動靶基因的轉錄。利用HIF-1/HRE基因調節系統調節靶基因的轉錄與表達是近年來的研究熱點，并廣泛用于以缺氧為特征的疾病的基因治療研究，如缺血性心腦血管疾病、腫瘤等。

在基因治療的載體研究中，近年來較為注重組織特異性和基因表達可調性的研究。非可調的基因表達載體，由于基因表達的不可調控，持續基因過表達可能引起一系列副作用，如血管生成因子不可調表達載體，當基因過表達時可引起的副作用有血管瘤、視網膜病、關節炎等，也有引起腫瘤的可能，因此可調控的真核基因表達載體(包括病毒載體和質粒載體)的研究越來越受到重視。

與病毒載體比較，質粒載體結構簡單，容易體外構建和大量擴增，使用方便，不產生免疫排斥等不良反應，也可反復使用；肌肉組織具有自主攝取裸DNA的特性，通過肌肉注射的方式可使基因導入體內，方法簡便安全，外源基因也可進行有效的表達。1998年Losordo等人采用含hVEGF₁₆₅的質粒載體，直接心肌內注射治療慢性心肌缺血病人，成功進行了臨床I期試驗，從而為應用質粒載體進行缺血性疾病(肢體動脈栓塞疾病、冠狀動脈閉塞性疾病，腦栓塞疾病等)的基因治療提供了一條新的治療途徑。

發明內容

本發明的目的是綜合利用上述技術，構建了一種缺氧誘導真核基因表達的質粒載體。

本發明的技術內容是：本發明構建了一種缺氧誘導真核基因表達載體。本實驗對pcDNA3.1進行了改造，將其增強子用缺氧誘導的增強子替代，構建了缺氧誘導基因表達載體；為了檢測缺氧誘導基因表達載體的功能，將hVEGF₁₆₅的cDNA插入到載體中，構建了含hVEGF₁₆₅的缺氧誘導真核基因表達載體p6HRE-hVEGF₁₆₅，并將該載體轉入BHK細胞中，用免疫組化的方法檢測hVEGF₁₆₅，證明將該載體可表達外源基因；表達hVEGF的BHK細胞在缺氧環境下培養，用ELISA的方法檢測培養上清液中hVEGF的含量，結果證明缺氧誘導后hVEGF的表達量增加。將p6HRE-hVEGF₁₆₅用于家兔肢體缺血性疾病的基因治療，可有效地促進患肢新生血管和側支循環的形成，使患肢脛動脈壓恢復。目前，缺氧誘導基因表達載體可用于缺血性疾病的基因治療和腫瘤的基因治療。

具有缺氧反應元件HRE的真核基因質粒表達載體，可在缺氧條件下使基因表達增強，實現目的基因的可控性表達。將促進血管生成的血管內皮細胞生長因子(VEGF)重組到缺氧誘導真核基因質粒載體中，用于缺血性疾病的基因治療，不僅使用方便安全，也可實現VEGF基因表達的可調性，如在心肌、肢體缺血部位局部注射基因，缺氧誘導VEGF基因高表達，促進血管再生，改善缺血性病變部位的血液供應，從而達到治療目的；當缺氧情況好轉，對基因誘導作用下降，可減輕或避免由于基因過度表達所致的副作用。這樣不僅為探索缺血性疾病的基因治療提供了基礎，還為其他與缺氧有關疾病及腫瘤的基因治療開?辟了新的途徑，具有重要的醫學研究和臨床應用價值。

附圖說明

圖1是缺氧誘導基因表達載體的構建圖；

去掉pcDNA3.1(+)中的啟動子和增強子序列，用6HRE-CMV_min取代，構建成缺氧誘導真核基因表達載體。

圖2是構建載體過程中應用的載體pEGFP-N1；

圖3是酶切鑒定載體p6HRE-hVEGF₁₆₅；

EcoRI：EcoRI雙酶切片段為626bp和5105bp

KpnI：KpnI雙酶切片段為733bp和4998bp

BamHI：單酶切片段為5731bp

SalI：酶切片段為470bp、733bp、2185bp和2333bp

M1??λDNA/Hind?III，DNA分子量標準

M2??200，400，600，800，1200，1600，1800(bp)；DNA小分子量標準