[發(fā)明專利]沙冬青CBL1基因啟動子的鑒定及其功能研究

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710195058.6
• 申請日: 2007-12-11
• 公開（公告）號: CN101457227A
• 公開（公告）日: 2009-06-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 夏新莉;尹偉倫;于艷華
• 申請（專利權(quán)）人: 夏新莉;尹偉倫;于艷華
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/82;A01H1/00
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及沙冬青(Ammopiptanthus?mongolicus)CBL1基因啟動子AmCBL1P的鑒定，數(shù)據(jù)庫分析，其缺失片斷植物表達載體的構(gòu)建及該啟動子的應(yīng)用。

背景技術(shù)

鈣離子作為第二信使，在植物多種非生物脅迫(干旱，低溫，鹽堿)信號轉(zhuǎn)導過程中有非常重要的作用。從鈣離子到基因表達，許多信號因子在這個工程中起重要作用。Ca²⁺通過與鈣結(jié)合蛋白的特應(yīng)性結(jié)合把信號傳遞到下游。鈣結(jié)合蛋白主要有三類：CaM，CDPK和CBL。CBL蛋白是最新發(fā)現(xiàn)的鈣結(jié)合蛋白。1999年，kudla等首次在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了三種CBL蛋白，它們和哺乳動物中的鈣調(diào)磷酸酶B亞基和神經(jīng)元鈣結(jié)合元件相似。在擬南芥基因組中共發(fā)現(xiàn)10個CBL家族成員，即AtCBL1-10，該組蛋白皆包含4個EF-hand結(jié)構(gòu)，本身沒有酶活性，通過與目的蛋白CIPK(CBL-interacting?protein?kinase)特異性結(jié)合而起作用。CBL家族中對CBL1基因的研究最為詳盡。在擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)，CBL1可以受多種脅迫如干旱、高鹽等誘導，超量表達CBL1基因能促進一系列逆境誘導基因的表達，并能提高擬南芥對干旱和鹽脅迫的耐受性，但卻降低其耐凍性，推測CBL1可能是干旱響應(yīng)的正調(diào)節(jié)因子和低溫響應(yīng)的負調(diào)控因子。2006年，Xu和Li首次在擬南介中發(fā)現(xiàn)：CBL1和CBL9通過與CIPK23相結(jié)從而合激活CIPK23，激活的CIPK23直接磷酸化一種鉀離子通道蛋白AKT1，在植物缺鉀的情況下，提高鉀離子的吸收。由此看來，CBL1是植物逆境信號傳導途徑中的傳遞元件和重要組分，很可能是信號途徑上游一個重要交叉節(jié)點。沙冬青(Ammopiptanthus?mongolicus)是我國沙漠地區(qū)唯一的生常綠灌木，在長期的惡劣環(huán)境中形成了極強的抗旱，耐寒性。因此，以沙冬青為材料，分離其CBL1基因的啟動子，研究其功能，以期闡明強抗逆性植物沙冬青CBL1基因的上游調(diào)控機制，為提高植物抗逆性基因工程提供新的思路。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明以強抗逆性植物沙冬青為材料，克隆了受多種脅迫誘導的CBL1基因的上游啟動子序列，PLACE數(shù)據(jù)庫分析其序列，發(fā)現(xiàn)該序列具有啟動子的基本元件TATA-box、CAAT-box，包含多處與干旱，高鹽和激素誘導相關(guān)的順式作用元件的同源序列。并構(gòu)建了相應(yīng)得缺失表達載體。本研究對揭示沙冬青CBL1基因的上游調(diào)控機制，提升植物抗逆性，具有重要的科學意義。

本文在已知沙冬青CBL1?cDNA序列(GenBank的注冊號位AY902246)的基礎(chǔ)上，借鑒5’RACE策略，利用錨定PCR步移的方法克隆了沙冬青CBL1基因1683bp的5’側(cè)翼序列，命名為AmCBL1P。采用5’RACE技術(shù)，得到了AmCBL1基因上游124bp的5’非翻譯區(qū)(UTR)。將1683bp?AmCBL15’側(cè)翼序列與其5’UTR序列進行比對，重疊的部分相似率達100％。有趣地是，經(jīng)過序列比對，我們在基因組上發(fā)現(xiàn)AmCBL1基因的5’非翻譯區(qū)插入了一個長度為690bp的內(nèi)含子。這與在擬南芥中得到的結(jié)果相似。在擬南芥基因組中，AtCBL1基因5’端也存在一個內(nèi)含子，位于起始子ATG前123bp處，長度為411bp。5’端內(nèi)含子究竟起什么作用，還需要實驗進行進一步驗證。

啟動子上通常會有一些特殊的DNA序列，即順式作用元件，轉(zhuǎn)錄因子與之結(jié)合，從而抑制或激活基因的轉(zhuǎn)錄。經(jīng)實驗證明，AmCBL1基因表達受水分脅迫(干旱、鹽等)和脫落酸的誘導。受水分脅迫和ABA誘導表達的基因的啟動子序列中，常有一些起關(guān)鍵作用的功能元件，大多數(shù)受干旱誘導的基因上游存在干旱誘導元件DRE(dehydration-responsive?element)，受ABA誘導的基因的啟動子中常含有ABRE(ABA-responsitive?element)元件等。