[發明專利]一株海因酶和氨甲酰水解酶產生菌、雙酶基因及制備L－氨基酸的應用

有效

• 申請號: 200710191968.7
• 申請日: 2007-12-28
• 公開（公告）號: CN101215533A
• 公開（公告）日: 2008-07-09
• 發明（設計）人: 何冰芳;歐陽平凱;梅艷珍;柏中中;姜岷;周華;韋萍
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N9/78;C12N15/55;C12P13/04;C12R1/01
• 代理公司: 南京知識律師事務所
• 代理人: 汪旭東

技術領域

本發明屬于應用微生物技術領域，具體涉及一種同時產海因酶和L-N-氨甲酰水解酶的新微生物Bacillus?fordii?MH602菌株、該菌株所產的海因酶和L-N-氨甲酰水解酶基因、以及利用該菌株制備系列光學純L-氨基酸的應用。

背景技術

天然L-氨基酸及非天然L-氨基酸及其衍生物在食品、醫藥、農業等行業有廣泛應用研究。海因酶和L-N-氨甲酰水解酶是生產天然、非天然L-氨基酸及其衍生物的關鍵生物催化劑之一，特別適用于常規發酵法難以生產的人體必須氨基酸和非天然氨基酸。近年來，非天然L-氨基酸可作為功能蛋白抑制劑的成分，預防HIV感染、纖維蛋白原受體的多肽配體，速激肽拮抗劑、神經原受體配體等。非天然氨基酸廣泛用于合成生物活性肽，作為天然氨基酸的代替品。因其改變的疏水側鏈帶來諸多好處而應用于多肽合成：阻止疏水口袋變小、親油性高、穩定性高、蛋白酶難以降解。

不同微生物產生的海因酶或L-N-氨甲酰水解酶在底物特異性及熱穩定性等方面同存在明顯差異，因而導致不同微生物產生的海因酶或L-N-氨甲酰水解酶在工業應用方面存在重要差異。如Bacillus和Arthrobacter僅轉化DL-5-甲硫乙基海因為L-蛋氨酸，而Pseudomonas可轉化DL-對羥基苯海因生成D-對羥基苯甘氨酸。在生產相關L-氨基酸的工藝中，海因酶和L-N-氨甲酰水解酶熱穩定性較低，特別是L-N-氨甲酰水解酶活性低，穩定性差，起到“瓶頸”的作用，如來自Agrobacterium的L-N-氨甲酰水解酶穩定性較差，30℃半衰期僅為lO分鐘；來自嗜熱古細菌Methanococcus屬的海因酶雖然有較好的熱穩定性，半衰期在90℃為100分鐘，但該菌僅產海因酶且僅對海因有較好的催化效果。

不同微生物菌屬所產生的海因酶或L-N-氨甲酰水解酶在基因序列上同樣存在很大差異，數據中所報道的海因酶基因序列同源性僅為20～40％，相同菌屬微生物物種所產海因酶同源性為40～90％，而L-N-氨甲酰水解酶同源性更低，同源性不超過40％，如來自Bacillus?kaustophilus的L-N-氨甲酰水解酶(GeneBank接收號AF425838)，Arthrobater?aurescens的L-N-氨甲酰水解酶(GeneBank接收號AF071221)，來自Pseudomona?sp.NS671的L-N-氨甲酰水解酶(GeneBank接收號D90469)等。而D-氨甲酰水解酶與L-氨甲酰水解酶的同源性低于15％。

近年來，海因酶和L-N-氨甲酰水解酶用于研究開發相關產品，具有工藝簡單、光學純度高等特點，研究比較活躍。因此尋求高穩定性及高活性的海因酶與L-N-氨甲酰水解酶產生菌并研究海因酶系基因序列特征具有重要意義。

發明內容

本發明的目的是提供一株同時產海因酶和L-N-氨甲酰水解酶的菌株，該菌株產生的海因酶和L-N-氨甲酰水解酶能克服目前生物轉化DL-5-取代海因或N-氨甲酰氨基酸制備L-氨基酸過程中海因酶和L-N-氨甲酰水解酶的活性和熱穩定性較差的缺點，并將該菌株成功應用于L-氨基酸高效生產上。

為實現以上目的，本發明采用的技術方案主要分以下三部分：

一、本發明以DL-5-取代海因作為唯一氮源從土壤中篩選到一株能同時產海因酶和L-N-氨甲酰水解酶的菌株，分類命名為Bacillus?fordii?MH602，其保藏登記號為CCTCCNo：M?206144。

本發明將Bacillus?fordii?MH602經BIOLOG全自動細菌鑒定儀鑒定，表明該菌株MH602與芽孢桿菌Bacillus?sp.相似度(SIM)為0.52，而16SrDNA序列分析鑒定表明與該序列相似度高于98％的菌株均為Bacillus屬菌株，其中與菌株BacillusfordiiAY443039相似度為98.6％。

本發明對Bacillus?fordii?MH602的生物特征進行了鑒定，該菌株為革蘭氏陽性菌，有芽孢形成。在肉湯平板培養基中生長16小時后，菌落大小為2～2.5mm，生長溫度范圍是40～55℃，最適溫度是45℃，生長pH是6.5～8.5，最適pH是7.5，其生理生化表現在，過氧化物酶試驗陽性，在有氧條件下生長。