[發(fā)明專利]對有機磷農(nóng)藥抗性野桑蠶種群的檢驗方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710190620.6
• 申請日: 2007-11-20
• 公開（公告）號: CN101178400A
• 公開（公告）日: 2008-05-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李兵;沈衛(wèi)德;貢成良;許雅香;衛(wèi)正國;陳玉華;王東;趙華強
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州大學(xué)
• 主分類號: G01N33/50
• 分類號: G01N33/50;G01N21/78
• 代理公司: 蘇州創(chuàng)元專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司
• 代理人: 陶海鋒

????????????????????????????技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種野桑蠶的研究方法，具體涉及一種野桑蠶抗藥性的研究方法。

????????????????????????????背景技術(shù)

野桑蠶(Bombyx?mandarina?M.)屬于鱗翅目昆蟲，和家蠶具有共同的起源，棲息在桑樹上，取食桑樹的葉片，是危害桑樹的主要害蟲之一。由于長期的自然選擇，現(xiàn)有的野桑蠶對農(nóng)藥的抗性遠(yuǎn)高于家蠶。由于其發(fā)生規(guī)律和家蠶的蠶期具有同步性，蠶期使用農(nóng)藥防治野桑蠶，桑葉殘留的農(nóng)藥會造成家蠶的農(nóng)藥中毒，給野桑蠶的防治帶來一定的困難。

目前有機磷類農(nóng)藥是防治野桑蠶的主要農(nóng)藥之一，伴隨著有機磷農(nóng)藥的大量使用，野桑蠶在有機磷農(nóng)藥的壓力選擇下，其對有機磷農(nóng)藥有抗性有來斷增強的趨勢，我國的主要蠶區(qū)都報道過有對有機磷農(nóng)藥抗性野桑蠶種群的出現(xiàn)，嚴(yán)重影響蠶桑的正常生產(chǎn)。對野桑蠶種群的有機磷農(nóng)藥抗性進(jìn)行檢驗，鑒定其為敏感種群和抗性種群，對于科學(xué)防治方法的確立，具有重要意義。敏感種群可采用常規(guī)濃度的防治方法，避免過量使用農(nóng)藥，以減少農(nóng)藥對環(huán)境的危害；抗性種群可采用農(nóng)藥品種替換和暫停飼養(yǎng)家蠶集中防治相結(jié)合的方法，以提高防治效果。

目前，我國對野桑蠶種群的有機磷農(nóng)藥抗性研究開展的較少，通常使用的方法是把野桑蠶采集后，集中添毒進(jìn)行試驗。由于采用家蠶的飼養(yǎng)方法很難飼養(yǎng)野桑蠶，另外，室內(nèi)長期飼養(yǎng)的野桑蠶的生理機能較野外的差，不具有客觀的代表性，研究發(fā)明針對野外生存的野桑蠶種群的有機磷抗性檢驗方法，對于解決野桑蠶的防治難題具有重要的現(xiàn)實意義。

????????????????????????????發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供一種快速、經(jīng)濟(jì)、方便、靈敏度高的對有機磷農(nóng)藥抗性野桑蠶種群的檢驗方法。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明通過野桑蠶血液里的酯酶和底物的反應(yīng)，利用濾紙的顯色來檢驗野桑蠶種群對有機磷農(nóng)藥的敏感性。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種對有機磷農(nóng)藥抗性野桑蠶種群的檢驗方法，包括下列步驟：

(1)材料的準(zhǔn)備，包括，

將β-乙酸萘酯溶解在丙酮中，濃度為2-3mg/mL，然后加入25倍體積的pH?7.0的磷酸鹽緩沖液，再用蒸餾水稀釋至2倍，配制成底物溶液；

在桑田隨機收集野桑蠶5齡幼蟲至少100頭，保存在3～8℃培養(yǎng)冰箱中備用；

(2)試驗：

取1頭上述野桑蠶5齡幼蟲，用剪刀剪去幼蟲的腹足，取其血液滴于準(zhǔn)備好的濾紙上；吸有血液的濾紙浸入37℃的底物溶液中至少15秒，然后放于玻璃板上，在濾紙上放0.2-0.3mL?0.4％的固蘭B鹽，1分鐘后，加0.2-0.3mL的三氯乙酸；

(3)顯色分析：

濾紙吸收酶液的部分及四周，反應(yīng)顏色略帶紫色的個體為對有機磷抗性個體，反應(yīng)顏色不明顯的個體為敏感個體；

(4)重復(fù)步驟(2)、(3)，記錄抗性個體和敏感個體的數(shù)量。

上述步驟(4)中，根據(jù)所記錄的抗性個體和敏感個體的數(shù)量，得出對有機磷農(nóng)藥抗性的比率為

上述技術(shù)方案中，所述的濾紙選用色譜分析濾紙，應(yīng)符合下列要求：質(zhì)地均勻平整，具有一定機械強度，必須不含會影響色譜效果的雜質(zhì)，也不應(yīng)與所用顯色劑起作用，以免影響分離和鑒別效果。

上述技術(shù)方案中，所述底物溶液為隨配隨用，不適合于長時間保存。

上述技術(shù)方案中，試驗材料的取樣要隨機分布，以保證實驗結(jié)果具有代表性。

上述技術(shù)方案中，滴有血液的濾紙應(yīng)盡快浸入底物溶液里，以免酚氧化酶的氧化作用，影響顯色的觀察效果。

本發(fā)明的技術(shù)方案的工作原理為：野桑蠶的血液中含有一定量的酯酶(包括羧酸酯酶和乙酰膽堿酯酶)，抗性個體的酯酶活性相對較強，敏感個體的酯酶活性較弱。酯酶可以和底物β-乙酸萘酯反應(yīng)，其產(chǎn)物可以和固蘭B鹽發(fā)生顯色反應(yīng)，在酸性條件下帶紫色的為抗性個體，不明顯的為敏感個體。

由于上述技術(shù)方案運用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點：

1.本發(fā)明檢驗方法的對象為野外害蟲，具有客觀的代表性；

2.本發(fā)明檢驗方法采用幼蟲血液與底物溶液反應(yīng)，并用顯色劑進(jìn)行顯色來判斷野桑蠶對農(nóng)藥的抗性，操作方便，檢驗成本低，特別適合于現(xiàn)場檢驗。

3.本檢驗方法的靈敏度高，檢驗快速。

????????????????????????????具體實施方式

下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述：