[發明專利]利用畢赤酵母制備重組人血紅蛋白

無效

• 申請號: 200710185047.X
• 申請日: 2007-11-06
• 公開（公告）號: CN101429245A
• 公開（公告）日: 2009-05-13
• 發明（設計）人: 中城圭介;帆足洋平;甲斐俊哉;宇野公之;小田切優樹
• 申請（專利權）人: 尼普洛株式會社
• 主分類號: C07K14/805
• 分類號: C07K14/805;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司
• 代理人: 郭文潔;劉 玥

技術領域

本發明涉及重組人血紅蛋白的制備及其所用的表達載體。更詳細而言，本發明涉及應用畢赤酵母屬酵母的人血紅蛋白的制備方法，以及包含以串連方式連接的、含有編碼人血紅蛋白β鏈的DNA的表達盒和含有編碼人血紅蛋白α鏈的DNA的表達盒的表達載體。

背景技術

血紅蛋白是一種在紅細胞中高濃度存在的蛋白質，具有運載以氧為代表的各種氣體分子的作用。其結構是分別由2條α鏈和β鏈構成的異四聚體。

作為利用血紅蛋白的制劑，已開發出紅細胞替代物。到目前為止，人們已經設計出血紅蛋白的修飾體—分子內架橋型、重合型、高分子結合型和將血紅蛋白封入脂質體的血紅蛋白小胞體。特別是血紅蛋白小胞體，從其形狀、血紅蛋白純度等物理特性、安全性、體內滯留性、體內動態、氧運載能力等生物學數據考良，可作為單次施用的、急救用輸氧液從而建立了實用化目標。

另一方面，使用人血液來源的血紅蛋白制劑時，擔心混入未知的病毒等，從安全性考慮，在人體內使用存在問題。但是，應用基因重組技術，通過轉化的微生物，可提供安全的血紅蛋白制劑。

到目前為止，關于基因重組型血紅蛋白的制備，主要應用大腸桿菌作為宿主細胞。但是，該手段中存在這樣的問題：(1)甲硫氨酸氨基肽酶等酶與血紅蛋白一起表達，N末端添加了多余的第一個甲硫氨酸，與天然型一級結構的序列不同；(2)為了合成血紅素，必須向培養液中添加氨基乙酰丙酸等。

關于應用釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)的基因重組型血紅蛋白的制備，目前為止已有2例報導(參照非專利文獻1和2)。該體系中，由于釀酒酵母自身具有的酶能剪切第一個甲硫氨酸，所以其一級序列與天然型完全一致。另外，合成血紅素時不必要向培養液中添加氨基乙酰丙酸。但是，從收率方面考慮，該方法也不十分滿意，此外也沒達到重組血紅蛋白的工業化生產。

作為酵母屬的其它工業用酵母的一種，已知有畢赤屬(Pichia)酵母。該酵母能以甲醇作為唯一的碳源進行增殖，在甲醇中生長時，能表達對甲醇及其代謝中間體進行處理所必要的酶，從而脫抑制。人們利用該甲醇同化途徑生產異種蛋白質進行了研究，已經將其應用于血液制劑用的白蛋白的制備(例如，參照特開平6-22784號公報)。其表達量非常高，從1L培養基中可制備出10g的白蛋白。

但是，當目的異種蛋白質與宿主細胞組合(相性)時，往往存在異種蛋白質的表達效率低的情況。特別是，象血紅蛋白這類異寡聚體蛋白質，必須清楚各亞單位間表達量的平衡和寡聚體形成等多種條件，不容易得到預期的高表達。實際上，畢赤酵母屬酵母用于人蛋白質的工業生產的例子極其有限。

非專利文獻1：Wagenbach，M.et?al.，Bio/Technol.，9：57-61(1991)

非專利文獻2：Coghlan，D.et?al.，Eur.J.Biochem.，207：931-936(1992)

本發明的目的是提供容易大量生產與天然型同樣的、具有充分的功能、活性，且不用擔心病毒混入的、安全的人血紅蛋白，白蛋白以及球蛋白等重組蛋白質的手段。

本發明者們為了達成上述目的進行了深入研究，用包含編碼人血紅蛋白α鏈和β鏈的DNA的表達載體之類的包含編碼多個蛋白質或肽鏈的DNA的表達載體，轉化作為畢赤酵母屬酵母的一種的巴斯德畢赤酵母(Pichia?pastoris)，在培養基中培養所得轉化體，結果成功地大量回收人血紅蛋白等各種蛋白質或肽，尤其是異寡聚體蛋白質等，從而完成了本發明。

發明內容

也就是說，本發明提供：

(1)一種功能性重組人血紅蛋白的制備方法，它包括在培養基中培養下述的畢赤酵母屬酵母，從所得培養物中回收人血紅蛋白，所述的畢赤酵母屬酵母是用包含在畢赤酵母屬酵母中能夠發揮作用的啟動子調控下的、編碼人血紅蛋白α鏈的DNA的表達載體，及包含在畢赤酵母屬酵母中能夠發揮作用的啟動子調控下的、編碼人血紅蛋白β鏈的DNA的表達載體轉化的畢赤酵母屬酵母。

(2)上面(1)描述的方法，編碼人血紅蛋白α鏈的DNA和編碼人血紅蛋白β鏈的DNA在同一載體上。

(3)上面(1)描述的方法，編碼人血紅蛋白β鏈的DNA位于轉錄方向的上游側。

(4)上面(1)～(3)任一項中描述的方法，編碼人血紅蛋白α鏈的DNA和編碼人血紅蛋白β鏈的DNA在各自的啟動子的調控下。

(5)上面(1)～(4)任一項中描述的方法，編碼人血紅蛋白α鏈的DNA和編碼人血紅蛋白β鏈的DNA在乙醇氧化酶1啟動子的調控下。