[發明專利]以豬小腸為原料聯產生產堿性磷酸酶和肝素鈉的聯產工藝

有效

• 申請號: 200710180501.2
• 申請日: 2007-11-21
• 公開（公告）號: CN101182495A
• 公開（公告）日: 2008-05-21
• 發明（設計）人: 王章存;吳學軍;王斌
• 申請（專利權）人: 鄭州市通源生物技術有限公司
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C08B37/10
• 代理公司: 鄭州中民專利代理有限公司
• 代理人: 姜振東

1.一種以豬小腸為原料聯產生產堿性磷酸酶和肝素鈉的聯產工藝，其特征在于：它包括以下步驟：①將豬小腸打漿粉碎；②加0.05mol/L含有氯化鎂、氯化鈉和氯化鋅的Tris-HCl緩沖液萃取；③正丁醇沉淀；④壓濾或離心分離；⑤步驟④中分離出的上清液用丙酮沉淀，再依此通過復溶離子交換色譜分離、真空濃縮、凝膠色譜分離、真空濃縮、冷凍干燥即得堿性磷酸酶產品；⑥步驟④中分離出的濾渣通過浸提、酶解、過濾、離子交換樹脂吸附、洗滌去雜質、洗脫得到肝素、再經醇沉淀脫水干燥得粗品肝素鈉、雙氧水處理、過濾、濾液用乙醇沉淀、沉淀物用丙酮脫水干燥即得精品肝素鈉。

2.根據權利要求1所述的生產堿性磷酸酶和肝素鈉的聯產工藝，其特征在于：所用Tris-HCl緩沖液內含有0.01mol/L氯化鎂-0.01mol/L氯化鈉-0.01mol/L氯化鋅。

3.根據權利要求1所述的生產堿性磷酸酶和肝素鈉的聯產工藝，其特征在于：步驟⑤中的復溶離子交換色譜分離所用的交換柱為DEAE?Sepharose?4B柱(3.5cm×100cm)，每次加樣量為30ml。

4.根據權利要求1所述的生產堿性磷酸酶和肝素鈉的聯產工藝，其特征在于：步驟⑤中的凝膠色譜分離所用的層析柱為Sephadex?G-150。

5.根據權利要求1所述的生產堿性磷酸酶和肝素鈉的聯產工藝，其特征在于：步驟⑥中的酶解是通過加入新鮮豬胰漿或商品胰蛋白酶實現的。

6.根據權利要求1所述的生產堿性磷酸酶和肝素鈉的聯產工藝，其特征在于：步驟⑥中的離子交換樹脂為D-204大孔吸附樹脂。

7.根據權利要求1所述的生產堿性磷酸酶和肝素鈉的聯產工藝，其特征在于：步驟⑥中的兩次過濾所得的濾渣經干燥即為蛋白飼料。

8.根據權利要求1所述的生產堿性磷酸酶和肝素鈉的聯產工藝，其特征在于：步驟⑤的具體過程為：

a、在濾液中加入等體積冷丙酮，混勻后于轉速3000-6000r/min下離心10-20min，棄去上清液；

b、向沉淀中加入少量0.05mol/L?Tris-HCl緩沖液(pH7.5，內含0.01mol/L氯化鎂-0.01mol/L氯化鈉-0.01mol/L氯化鋅)，充分攪拌使其溶解即為所得堿性磷酸酶粗酶液；

c、將粗酶液加進用0.05mol/L?Tris-HCl緩沖液(pH7.5，內含0.01mol/L氯化鎂-0.01mol/L氯化鈉-0.01mol/L氯化鋅)平衡過的DEAE?Sepharose?4B柱(3.5cm×100cm)中，每次加樣量為30ml，采用含有NaCl的0.05mol/LTris2HCl緩沖液(pH?7.5)洗脫，其中含NaCl濃度由0至1mol/L的線性梯度洗脫，流速為0.5mL/min，部分收集，每管收集4mL，用280nm檢測洗脫峰，用磷酸苯二鈉為底物檢測洗脫峰的酶活力，并將有活力的洗脫峰合并；

d、將合并的活性洗脫液用旋轉薄膜蒸發器于35℃以下真空濃縮，使其中蛋白質的濃度達到約1％；

e、將酶蛋白濃縮液加進Sephadex?G-150凝膠過濾柱層析(2.5cm×100cm)，采用恒壓裝置，壓差為20cm.洗脫液為0.01mol/L?Tris2HCl緩沖液(pH7.5，內含0.2mol/L?NaCl)，流速為0.5mL/min，部分收集，每管體積約4mL，用280nm檢測洗脫峰，用磷酸苯二鈉為底物檢測洗脫峰的酶活力，并將有活力的洗脫峰合并；

f、將合并的活性洗脫液用旋轉薄膜蒸發器于35℃以下真空濃縮，當其中蛋白質的濃度達到約1％時冷凍后，采用真空冷凍干燥方法得到堿性磷酸酶粉劑。

9.根據權利要求1所述的生產堿性磷酸酶和肝素鈉的聯產工藝，其特征在于：步驟⑥的具體過程為：

a、濾渣放入水解鍋中，按1∶3-5比例加入0.9％氯化鈉溶液，用氫氧化鈉調pH至9.0后，加熱至50-60℃，保溫2-3小時；

b、酶解：將pH調整為8.0-8.5，溫度調整為37-40℃，加入相當于腸粘膜0.8-1.0％已經絞碎的新鮮豬胰槳，也可加入0.25％商品胰蛋白酶，攪拌條件下保溫水解3-4小時，并通過加入10％的氫氧化鈉溶液保持該pH的穩定；

c、過濾：酶解結束后，用10％稀鹽酸調整pH為5.5-6.0，，然后升溫至90-95℃，攪拌條件下加入氯化鈉至5％，并保溫30min，趁熱過濾除去不溶性雜質。濾渣再用5％的氯化鈉溶液濾液洗滌一次，合并濾液即為肝素粗提液，濾渣用于動物蛋白飼料；

d、離子交換樹脂吸附：將肝素粗提液冷卻到10℃左右，靜置后除去可能出現的表面凝固層，然后加熱至40-45℃，調整pH值為8.5-9.0后，緩慢攪拌條件下加入D-204大孔吸附樹脂中，樹脂的用量約為料液的2.5-3.0％，吸附時間為3-5小時，然后，用尼龍布袋濾掉液體，收集樹脂(有肝素吸附)；

e、洗滌：用水反復沖洗吸附后的樹脂，直到沖洗液變清為止；

f、洗脫：先用3-4％的氯化鈉溶液洗滌除去部分雜質；再用12-15％氯化鈉溶液洗滌除去硫酸皮膚素；最后樹脂浸泡到25-30％的氯化鈉溶液中，并輕輕攪動5-8小時后，過濾，并用該氯化鈉溶液重新洗滌一次樹脂，合并收集濾液；

g、醇沉淀：在聚攪拌下往濾液中加入乙醇，使其終濃度達到40-45％，靜置3-5小時后虹吸上層醇溶液(乙醇可回收利用)，取沉淀部分，用約2倍1％氯化鈉溶液復溶后，用乙醇二次沉淀5-8小時；

h、脫水干燥：沉淀物用2倍量的95％或無水乙醇脫水二次，再用丙酮脫水一次，濾干，50℃以下真空干燥箱中慢慢干燥，此時，肝素鈉的效價可在90USP?u/mg以上；

i、將粗品肝素鈉用1.5％的氯化鈉配制成10％溶液，用鹽酸調整pH?1-2，迅速過濾，上清液再用氫氧化鈉溶液調整到pH?10-12，按照3.5％量加入30％雙氧水，于25℃下放置40小時以上，其間維持pH10-12，然后過濾并收集濾液；

j、濾液用稀鹽酸調整pH6-7后，加入等量的無水乙醇，輕輕攪勻后靜置12小時以上，取沉淀部分，并用丙酮脫水后干燥，即為精品肝素鈉。