[發明專利]山羊痘疫苗株表達載體

無效

• 申請號: 200710180005.7
• 申請日: 2007-10-24
• 公開（公告）號: CN101418314A
• 公開（公告）日: 2009-04-29
• 發明（設計）人: 陳創夫;郭志儒;李有文;魏風
• 申請（專利權）人: 石河子大學
• 主分類號: C12N15/863
• 分類號: C12N15/863;A61K48/00
• 代理公司: 石河子恒智專利代理事務所
• 代理人: 王 勇

技術領域：

本發明提供一種用于在重組山羊痘病毒中表達外源蛋白的表達載體，屬于生物技術領域。

背景技術：

現代分子生物學的發展，使人們能夠操縱各種生物的基因，掌握了在細菌質粒中克隆、重組DNA的技術，從而大大擴展了人們制作疫苗的方法，研究出了多種基因疫苗來防治動物疫病，病毒載體活疫苗就是其中之一。

很早以前，人們在同天花斗爭的過程中，就對于痘病毒具有堅強免疫保護的能力有了深刻的認識。了解到痘病毒是動物病毒中最大的病毒，在光學顯微鏡下即可看見。在電子顯微鏡下，病毒呈磚形外觀。病毒基因組由單分子雙鏈DNA組成，G+C含量的32％-64％。基因組長度為130-380kb。病毒最主要的成分是蛋白質，脫氧核糖核算酸和類脂，聚丙烯酰胺凝膠電泳分析病毒粒子顯示有100多種包括結構蛋白、翻譯mRNA的酶及RNA合成、DNA復制等相關酶在內的病毒相關蛋白。現在人們進一步發現痘病毒在復制過程中存在著同源序列重組現象，而且在痘病毒的基因組中存在著許多病毒復制非必需區域，所以人們可以首先將病毒復制的非必需區克隆到細菌質粒中，再把啟動外源基因的啟動子(由于痘病毒利用自己的RNA聚合酶在感染宿主細胞的細胞漿中復制，因此必須用痘病毒的啟動子)插入非必需區，構建成重組表達載體，然后把要表達的外源基因插入到已經在病毒復制非必需區中的啟動子下游，得到重組表達質粒，利用此質粒與病毒親本在細胞內復制時發生同源重組，即可獲得表達外源基因的重組病毒。將此重組病毒免疫動物時，病毒在動物體內復制過程中則可表達攜帶的外源基因，刺激動物機體產生對外源蛋白的特異性免疫反應，因此可作為重組活載體疫苗用于人和動物的疾病防治。目前，痘苗病毒(Vaccinia?virus?VV)的基因組序列已經明確，因此作為承載外源基因的載體，它是最早應用也是應用最多的病毒載體。歐洲國家于80年代后期研制的以痘苗病毒為載體的狂犬病重組疫苗在野外的成功應用，已經使這些地區的野生動物狂犬病得到了有效的控制。

目前為止，已經有多種類型的具有生物活性的蛋白質在重組VV中得到表達，而由此獲得的表達各種病原的重組VV成為預防與治療人與動物多種傳染性疾病乃至腫瘤的重組活載體疫苗。但由于VV感染廣泛的宿主范圍和個別個體接種VV后產生的副反應，尤其是免疫缺陷個體接種VV后產生病毒血癥而有擴散病毒的危險。所以，以VV為載體的重組疫苗的安全性引起了人們越來越多的擔憂。因此逐漸開始轉用宿主特異性更強的其他痘病毒作為活疫苗的載體。例如痘病毒科禽痘病毒屬中只感染禽類的雞痘病毒、金絲雀病毒等。

FPV雖然僅對對哺乳動物細胞產生流產性感染，而能表達提呈外源抗原，作為替代痘苗病毒(VV)的哺乳動物非復制型表達載體來應用具有較大潛力，但對于實際用于牛羊等反芻動物疫苗載體的可能性和應用效果上需做更多的工作。

和痘苗病毒一樣，羊痘病毒基因組較大，有表達多個外來基因的潛力，且將外來基因插在羊痘病毒的非編碼區，既不影響其復制也不會影響其抗原性。同時羊痘病毒自然條件下只感染牛羊等反芻動物類(這種意義上的感染指能產生感染性病毒粒子的感染)，而對人和其它哺乳動物無傳染性。弱毒疫苗的實踐證明，病毒釋放到環境中也不傳播給其他動物。因此作為用于牛、羊等重大傳染病重組疫苗的載體，比痘苗病毒更安全性和其他無與倫比的優點。又由于培育這些疫苗株具有很好的免疫原性。也使得他們成為構建重組疫苗的理想載體。故引起了預防獸醫學領域的重視。

羊痘病毒基因組結構與復制特性與VV有著許多相似之處，故可以用構建VV載體的策略構建CPV載體。T?aylor等構建的LSDV表達載體已經重組表達了狂犬病毒糖蛋白基因和血凝素基因，分別能保護哺乳動物免受相應病原的攻擊。

目前從綿羊、山羊和牛中分離的羊痘病毒都有一個相同的主要中和位點，感染某一株病毒的康復動物對其他病毒的感染具有抗性，綿羊和山羊以一株痘苗病毒免疫后，可以抵抗所有田間毒株的感染，不論感染毒株來源于亞洲或非洲。隨著羊痘疫苗特別是弱毒疫苗在我國的應用，大部分地區的羊痘得到了有效的控制。但是為了預防羊痘的發生，該地區每年要對羊群至少進行一次羊痘活疫苗的免疫，加上其他疫病的免疫，羊的防疫要花更多的時間和更高的成本。研制以羊痘病毒弱毒疫苗株為載體的如口蹄疫、藍舌病等其他嚴重威脅養羊業的重大疫病或者其他外來疫病的羊痘病毒二價或多價活疫苗，這樣在不增加防疫成本的情況下，達到一次免疫預防兩種或多種疫病的目的，這不僅對于當地的畜牧業生產，而且對于提高疫區動物抵御外來疫病的綜合能力，確保國家生物安全方面也具有重要意義。