[發(fā)明專利]一種檢測三聚氰胺的直接競爭法酶聯(lián)免疫試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710179475.1
• 申請(qǐng)日: 2007-12-13
• 公開（公告）號(hào): CN101206223A
• 公開（公告）日: 2008-06-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊曙明;于洪俠
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所
• 主分類號(hào): G01N33/543
• 分類號(hào): G01N33/543;G01N21/17
• 代理公司: 北京匯澤知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 張瑾

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及酶聯(lián)免疫和獸藥殘留檢測領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種用于檢測三聚氰胺的直接競爭法酶聯(lián)免疫試劑盒。

技術(shù)背景

三聚氰胺(Melamine)，簡稱三胺，學(xué)名三氨三嗪，別名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺，是一種重要的氮雜環(huán)有機(jī)化工原料，白色結(jié)晶粉末，無味。這種化學(xué)品常被用于生產(chǎn)塑料、膠水和阻燃劑，在部分亞洲國家，它也被用以制造化肥。它是一種禁止用于寵物食品及動(dòng)物飼料的化學(xué)物質(zhì)，動(dòng)物食用后可以使動(dòng)物發(fā)生腎衰竭并導(dǎo)致死亡。

2007年3月中旬以來，美國發(fā)生多起寵物貓、狗中毒死亡事件。經(jīng)調(diào)查，是由于一些寵物飼料供應(yīng)商為了增加飼料中蛋白質(zhì)的含量，在小麥蛋白粉和大米蛋白粉中添加了三聚氰胺，從而導(dǎo)致貓、狗中毒死亡。

因此亟需建立方便快捷且靈敏度高的檢測方法，禁止此類事件的發(fā)生。

現(xiàn)有的三聚氰胺檢測方法多為色譜法，但是這些方法需要有完善的實(shí)驗(yàn)室，有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員，復(fù)雜的儀器設(shè)備，且檢測過程繁瑣，不適應(yīng)現(xiàn)場大量樣本的篩查。基于抗原抗體免疫反應(yīng)的免疫學(xué)檢測技術(shù)為小分子殘留物的分析檢測提供了一個(gè)新的途徑。基于此原理建立的直接競爭法酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)較間接方法進(jìn)一步縮短了檢測時(shí)間。該技術(shù)的關(guān)鍵是完全抗原和酶標(biāo)記抗原的合成及抗體的制備。

目前，三聚氰胺的直接競爭酶聯(lián)免疫檢測方法尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種快速檢測三聚氰胺的酶聯(lián)免疫試劑盒。

本發(fā)明提供了一種快速檢測三聚氰胺的酶聯(lián)免疫試劑盒，該試劑盒包括：三聚氰胺特異性抗體酶標(biāo)板、酶標(biāo)三聚氰胺。其中三聚氰胺特異性抗體為兔抗三聚氰胺的多克隆抗體，用三聚氰胺與載體蛋白偶聯(lián)物作為免疫原通過免疫動(dòng)物(例如兔)制得。所述的酶標(biāo)記三聚氰胺采用化學(xué)方法偶聯(lián)得到，標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶，所述偶聯(lián)方法為琥珀酸酐法。

用于制備所述酶標(biāo)板的固相材料，包括但不限于，例如，聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯。載體的形式是微量反應(yīng)板凹孔。

為方便現(xiàn)場檢測和大量樣本篩查，所述試劑盒還可以進(jìn)一步包括包被有三聚氰胺特異性抗體的酶標(biāo)板、三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液、顯色劑、洗滌液、終止液、酶標(biāo)物稀釋液和濃縮樣品稀釋液。

所述的洗滌液為0.05％-0.5％吐溫-20磷酸鹽緩沖液。所述的顯色劑由顯色劑A液和顯色劑B液組成(例如，體積比為1∶1)，顯色劑A液為過氧化氫或過氧化脲，顯色劑B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺。所述的濃縮樣品稀釋液為含0.1％吐溫-20的磷酸鹽緩沖液，所述的酶標(biāo)物稀釋液為含0.01％吐溫-20的磷酸鹽緩沖液。

另一方面，本發(fā)明還提供了一種檢測飼料樣品中三聚氰胺含量的方法，包括步驟：

(1)樣品前處理；

(2)用權(quán)利要求1-9任一所述的試劑盒進(jìn)行檢測，向包被有三聚氰胺抗體的酶標(biāo)板孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，再加入酶標(biāo)記三聚氰胺，孵育后洗滌拍干，加入顯色劑顯色、終止，用酶標(biāo)儀測定吸光度值；

(3)分析檢測結(jié)果。

本發(fā)明試劑盒的檢測原理為：

將三聚氰胺抗體包被于固相載體上，加入樣本或三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液并加入酶標(biāo)記三聚氰胺工作液，待測樣品中的三聚氰胺與酶標(biāo)記三聚氰胺競爭固相化的三聚氰胺抗體，通過洗滌出去未結(jié)合的酶標(biāo)記物，顯色后終止，測定樣品的吸光度值，該值與樣品中三聚氰胺的量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出三聚氰胺濃度范圍。

有益效果：

本發(fā)明檢測三聚氰胺的試劑盒主要采用直接競爭酶聯(lián)免疫測定法定性或定量檢測樣品中三聚氰胺含量；進(jìn)一步縮短了檢測時(shí)間，有間接競爭法的2個(gè)小時(shí)縮短為1個(gè)小時(shí)，對(duì)樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡單，能同時(shí)快速檢測大批樣品。

本發(fā)明該試劑盒采用高特異性的三聚氰胺多克隆抗體，主要試劑以工作液形式提供，可以減少試劑盒的操作步驟，為使用者節(jié)省時(shí)間并降低因操作步驟冗繁造成的誤差，本發(fā)明具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、高精確度、高準(zhǔn)確度、對(duì)儀器設(shè)備要求低、試劑保存時(shí)間長、自動(dòng)化程度高、無放射性同位素污染的等優(yōu)點(diǎn)，可在飼料及動(dòng)物源性產(chǎn)品檢測中發(fā)揮重要作用。

附圖說明

圖1為三聚氰胺抑制曲線。

提供下述實(shí)施例是為了更好地進(jìn)一步理解本發(fā)明，而決不對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容和保護(hù)范圍構(gòu)成任何限制。

?????????????實(shí)施例1三聚氰胺免疫原的合成及免疫血清的制備

1.1試劑與儀器