[發明專利]高耐受草甘膦的EPSP合酶及其編碼序列

有效

• 申請號: 200710177090.1
• 申請日: 2007-11-09
• 公開（公告）號: CN101429499A
• 公開（公告）日: 2009-05-13
• 發明（設計）人: 林敏;梁愛敏;陸偉;李亮;陳明;張維;平淑珍
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: C12N9/00
• 分類號: C12N9/00;C12N15/52;C12N15/82
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司
• 代理人: 張 濤

技術領域

本發明涉及一種新型高耐受草甘膦的EPSP合酶(5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶)，以及編碼該合酶的核苷酸序列。

背景技術

草甘膦(glyphosate)為Monsanto公司產品Roundup中的主要活性成分，該除草劑是一種廣譜滅生性、內吸傳導型優秀除草劑，是全世界使用量最大的除草劑品種之一。但是，該除草劑也是一種非選擇性除草劑，對農作物同樣有著殺死作用。為在農業生產中使用草甘膦，須培育出具有草甘膦抗性或降解性質農作物。

草甘膦抑制植物莽草酸代謝過程中5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP)活性，進而阻斷芳香族氨基酸的生物合成而使植物死亡(S.R.Padgette?et?al.，in?Herbicide-Resistent?Crops：Agricultural，Environmental，Economic，Regulatory，and?TechnicalAspects，S.O.Duke，Ed.(CRC?Press，Boca?Raton，FL，1996)，pp.53-84)，當前全球商業化種植的所有草甘膦抗性轉基因作物均為針對EPSP所設計，是目前商業化轉基因抗草甘膦作物的唯一作用機制。應用化學誘變細菌產生的aroA突變體，抗藥性機理研究確證了aroA基因是草甘膦作用靶標EPSP合酶的編碼基因。美國Mosanto和Calegene等公司在EPSP合酶的編碼基因aroA及其抗草甘膦轉基因植物等方面已申請了100余份專利，獲得轉基因抗草甘膦大豆、玉米、油菜、甜菜和棉花等作物系列品種，其中大豆等多種轉基因作物已進入商品化生產。

目前尚未見到在核苷酸水平與已報道的EPSP合酶編碼基因(aroA)同源性較低的抗草甘膦的EPSP合酶。

發明內容

本發明的目的是發現并人工合成新型高耐受草甘膦的EPSP合酶以及編碼該合酶的核苷酸序列，并將該序列轉入植物中，培育新型的高耐受草甘膦的轉基因植物。

本發明首次發現了一種新型高耐受草甘膦的EPSP合酶，如SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列，以及編碼該合酶的核苷酸序列，如SEQ?ID?NO：2或SEQ?ID?NO：3所示。經序列結構分析和序列比較分析(見圖3)，顯示該EPSP合酶屬于I型EPSP合酶。

本發明采集草甘膦極端污染環境中土壤樣品，用免培養方法從中分離群落水平總DNA，構建群落水平總DNA粘粒文庫，并篩選草甘膦抗性轉化子；將轉化子點于含20mM草甘膦的M9固體培養基上篩選抗性轉化子。本發明還進行了草甘膦耐受實驗，結果表明上述轉化子具有非常強的草甘膦耐受活性。

本發明還進行了高耐受草甘膦的DNA片段的全核苷酸序列測定。分析結果表明，插入的片段大小為3151bp，其中包含了一個1335bp的閱讀框，其序列如SEQ?ID?NO：2所示，它包含的核苷酸序列全長為1335個堿基，其開放讀框位于885-2220位，編碼全長為445個氨基酸的EPSP合酶(如SEQ?ID?NO：1所示)。

本發明對上述高耐受草甘膦的EPSP合酶基因進行了人工合成，其序列如SEQ?ID?NO：3所示。將人工合成的5′和3′端酶切位點為BamHI和HindIII位點EPSP基因，用于表達高耐受草甘膦的EPSP合酶以及構建相應的基因植物表達載體。將上述人工合成的EPSP基因，用BamHI和HindIII酶切后，連入相同酶切的載體pET28a得到重組質粒pETGR-79并將其轉化大腸桿菌BL21(DE3)(Promega公司)。

本發明還進行了EPSP的酶活測定和動力學參數的測定，酶活性為10.477U/mg。K_i/K_m為2.16。根據動力學參數可知，GR-79?EPSP不僅具有較高的草甘膦抗性，而且還保持著與PEP較強的親和性，這些特性將為用于轉基因作物的培育提供可能。

本發明構建了高耐受草甘膦的EPSP合酶基因植物表達載體，利用葉盤法轉化構建抗草甘膦的轉基因煙草，經草甘膦抗性梯度實驗證明，轉基因植物能在含20mM草甘膦的培養基上良好生長。

本發明還提供了一種重組載體，它包含SEQ?ID?NO：2所述的DNA。本發明用上述重組載體轉化宿主細胞，這些宿主包括原核細胞，也包括真核細胞。

本發明還提供了一種利用轉基因技術將SEQ?ID?NO：2轉化入植物的方法，以提高植物對草甘膦抗性，其步驟如下：

(1)將SEQ?ID?NO：1或SEQ?ID?NO：2所示序列可操作地連于植物表達調控序列，形成植物表達載體；

(2)將步驟(1)中的表達載體轉入植物細胞；